动物细胞培养及外源基因的导入实验

相关专题

细胞培养 （Cell Culture）专题：
http://ask.bbioo.com/special/experiment/Cell culture.htm

细胞培养是现代生物学研究中应用最为广泛的技术之一。它的突出优点，一是研究对象是活的细胞，可长时期地监控、检测甚至定量评估其形态、结构和生命活动等；二是可以人为地严格控制研究条件，便于研究各种物理、化学、生物等外界因素对细胞生长、发育和分化等的影响，有利于单因子分析；三是研究的样本可以达到比较均一性。常用的细胞系均是性质均一的细胞，需要时还可采用克隆 化等方法使细胞进一步纯化；四是研究的内容便于观察、检测和记录。体外培养的细胞可采用显微镜，电镜等直接观察记录，充分满足实验的要求。另外还具有研究范围比较广泛，研究费用相对经济等优点。

然而，细胞培养也有其局限性。由于培养的细胞脱离了机体复杂的环境条件，其细胞形态和功能都会发生一定程度的改变。尤其是体外反复传代、长期培养的细胞，有可能发生染色体非二倍体改变等情况。因此，应将体外培养的细胞视为一种既保持动物体内原细胞一定的性状又具有某些改变的特定的细胞群体。

由于细胞培养技术的优点是其他实验方法和技术所不能比拟的，所以近年来细胞培养技术在分子生物学、细胞生物学、遗传学、老年学、免疫学、肿瘤学和病毒学等很多领域都得到了广泛的应用，其中对于分子生物学家及细胞生物学家而言，应用细胞培养对感兴趣的基因产物进行定位、运动及功能研究变得越来越重要。在克隆一个基因后的下一步，往往是将其导入不同类型细胞，以分析其表达，测定表达对细胞生长的影响，或将高表达的基因产物纯化。将外源DNA导入哺乳动物细胞有两种途径：稳定（永久）或暂时性转染。稳定转染的目的是将转移基因整合到细胞染色体DNA上，形成稳定表达转移基因的细胞系。一般需要共转染一个选择标记，用于追踪转染成功的细胞或转染效率。暂时性转染的目的是为了分析转移基因的暂时转录或表达，一般在转染后1-4天内进行。针对培养细胞的外源DNA导入已发展出多种技术，其中常用的有磷酸钙介导的转染，DEAE-葡聚糖介导的转染，脂质体介导的转染，电穿孔法等。这4种方法除DEAE-葡聚糖法外，均可用于暂时性转染和永久性转染。但它们有各自适用的细胞系。培养的细胞不同，其在摄取和表达外源DNA的能力上可能存在几个数量级的差异。因此针对细胞系优化并比较几种不同方法的效率很重要。

Graham和Vander EB（1973）首次报告了用Ca3(PO4)2-DNA沉淀将腺病毒SV40导入哺乳动物细胞的方法，Wigler等（1978）证明这种方法也能用于导入并在哺乳动物染色体上稳定整合外源DNA。至今对于磷酸钙介导的DNA转染的确切机理仍不清楚。一般认为转移DNA通过内吞作用进入细胞质，然后进入细胞核，而CaPO4处理被认为是产生了一种能促使DNA附着在细胞表面的环境。

细胞凋亡是细胞的一种基本生命现象，对于机体的组织发育、器官分化及多种病理过程均具有重要作用。细胞凋亡具有典型的形态学及生化特征。包括细胞膜皱缩，胞间连接减少，染色体凝集，细胞核崩解并形成凋亡小体等。其中一个强有力的生化指标是“DNA Ladder”的产生，由于凋亡相关的特异核酸酶在凋亡过程中的激活，凋亡细胞的总DNA可以在核小体间进行切割，提取总DNA进行电泳可以形成间隔180-200bp的阶梯状电泳条带（DNA Ladder）。一般认为出现DNA Ladder 的细胞肯定发生了凋亡，但并非所有发生凋亡的细胞都会出现DNA Ladder。这种检测方法也受到灵敏性的限制，只有当凋亡细胞占到细胞总量的15%以上时，特异降解的DNA经过电泳才会较好地显示DNA Ladder。