关于细胞培养的一些

细胞培养（Cell Culture）专题：
http://ask.bbioo.com/special/experiment/cellculture.htm

我现在的方向其实是生物医用材料，我对一次性生物材料的性质还算比较了解。对培养瓶、培养板的重复使用简单的说两句。
一般培养瓶、培养板、培养皿的材质都是生物相容性的聚苯乙烯，且要求具有较好的光学性能。在加工成型后，要进行组织培养处理。各公司用的方法都不太一样，而且这都是讳莫如深的商业秘密。其实不外乎两种，一种是物理方法，即使培养细胞的那个面的粗糙度适合细胞粘附生长；第二种是化学方法，用季铵盐、多肽或者血清、血浆等促进细胞粘附的物质涂覆表面。
在重复使用培养材料的时候，无论用什么方法洗，都会破坏这层很薄的处理层，使培养材料的生物相容性变差。如果这样的话，我们冒着培养物被污染的危险，还不如使用玻璃培养瓶呢。
我为什么推荐使用一次性细菌培养皿呢？其实这是国内供应商对这种培养皿的一个俗称，应该从字面上翻译成“一次性使用培养皿”，也就是“Disposable Petri Dish”。这是没经过组织培养处理过的聚苯乙烯培养皿，买回后自己用聚赖氨酸、明胶、血清处理一下，灭菌后使用，效果不比 细胞培养 皿差，成本却低了很多。尤其向大家推荐以色列Mini Plast公司的一次性培养皿，Φ90的才8角钱一个，质量极佳，比国产的同样价格的强许多。
还有，可以买比利时Orange公司的培养瓶，价格只有Coring或Nunc的60%，我使用了一年，效果不比Nunc和Coring的差，而且是经过人体工学处理的，使用起来很顺手。
其实DMEM细胞培养基的高糖和低糖对细胞培养影响并不大，我几年前刚开始做 细胞培养 时也常为此困扰。如果为了保险起见，选高糖的好了。培养基中的谷氨酰胺、丙酮酸钠浓度更重要，一定注意不同货号培养基之间的细小差别，最好选组分全加入的货号产品，毕竟省得不少另加试剂的开销。HEPES的添加也很关键，尤其对代谢旺盛的细胞更是如此。选血清时，宁可买Hyclone公司的新生牛血清，也不要用国产胎牛血清，切记。经济情况允许，建议用Hyclone的Define级血清，效果太好了。实际上国产胎牛血清都是新生牛，基本上都是病弱新生牛未哺乳前取的血，甚至不如进口新生牛血清，价格却相差不多。国产血清太“脏”了，其中的内毒素、支原体等指标都达不到要求，最近研究表明，内毒素是细胞凋亡的诱因之一。如果不做细胞因子和免疫相关的实验，建议血清不要灭活，灭活后严重影响细胞生长速度，且细胞贴壁率降低。

Gibico的血清很好，我读硕士时一直用。但是最近两年由于疯牛病的原因（Gibico的血清不都产在美国和澳洲，也有疯牛病发生的国家），进口的少，价格也贵。同一价格的前提下，毕竟Hyclone的Define级质量更好。Sigma的血清也很好，质量标准比Hyclone的还严格。具体选那种，还得根据您的工作性质而定，毕竟在国内科研经费有限，除非老板有上千万的项目，可以不计实验成本。

关于血清浓度和是否灭活，取决于您的具体实验，并没有严格的规定。一般原代细胞培养血清浓度稍高，我用20%，有利于提高细胞贴壁成活率，尤其是消化分离后没有培养而直接冻存的细胞复苏，就应该加25%血清。
如果做MTT实验或类似的四唑盐参与线粒体代谢的实验，血清浓度尽可能低一些，一般5%-10%，可以减少血清对结果的干扰，尤其是采用水溶液法（如加10%SDS盐酸溶解而不用DMSO）时更加重要。如果您做流式细胞分析，需要分析细胞周期，要经过一个“同步化”过程，有的学者用血清饥饿法，也就是24小时不加血清，使细胞周期趋于同步化。

我的细胞传代原则：不用EDTA，只用胰酶，先用D-hank\’s洗掉残留培养基和血清，然后按1ml胰酶/10cm2培养面积加入，镜下观察，待到细胞回缩明显且尚未脱壁时（这个过程不超过1分钟），倒掉大部分胰酶，只保留细胞表面被少量胰酶湿润，37度培养箱中放置5-15分钟，直至细胞可象流沙状下滑，加入含血清培养基终止消化，轻轻吹打使细胞散开，如有团块，可考虑200目筛过滤，可不洗涤离心细胞。此种方法对细胞伤害最小，如果做流式细胞分析，也可用此法，只不过在胰酶中加入等量EDTA溶液，出来的峰极规整漂亮。
某些细胞只用常规培养基不行，还必须补充生长因子或特殊量的氨基酸才能正常生长，要多参考相关文献。

另外，二氧化碳张力和温度也很重要，有些细胞需要较高的二氧化碳浓度或较特殊的温度。可选用透气盖培养瓶或培养皿培养板培养。

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