流式细胞术(PCM)在免疫学研究中的应用
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（1）免疫应用的激发光源和滤片系统：适用于免疫技术的FCM的激发光是氪离子气体激光器，光谱中波长为531nm和856nm的谱线最强。为了扩大仪器对双标记或三标记染色的荧光信号的分辨范围可使用双激光光源。
为了减少细胞由于激光束造成的散射光对光电倍增管的影响，要使用贴有干涉膜的滤片系统。为了同时测定两种波长以上的荧光信号，光路中还要使用二向性分光元件。
为了测定伴随细胞转化过程所产生的早期免疫及生化性质的改变，例如膜的流行性，DNA构象变化等，可以使用偏振片。
总之，应用于免疫学时要充分考虑有关光源及光学滤片系统的正确使用。
（2）免疫应用的荧光染料及染色：免疫应用中的荧光染料主要有FITC（488nm）、TRITC（515nm）、PE（藻红蛋白，575nm）及其组合。在进行多种标记时特别要注意结合抗体的每种色素都不干扰抗体反应的特异性，也不相互干扰。
免疫荧光染色有直接法和间接法二类：
①直接染色法
1）取约106 的细胞置于尖底离心管内，管内液体要少些。加荧光标记抗体，在4℃温度下静置15～30min。若作双标记染色也可直接加入。
2）用冷的10%的小牛血清、0.1%的叠氮钠溶液，1/15mol/L的PBS（pH4.4）离心清洗细胞2次。1000rpm离心5min或4000rpm离心1min。
3）加入适量缓冲液待测。
②间接染色法：
1）取106 细胞加特异的第一抗体，4℃ 温度下静置15～30min。
2）加缓冲液离心清洗2次后，吸尽残留液体，弹散沉淀，加入荧光标记的第二抗体，4℃ 静置30 min。
3）缓冲液离心清洗2次后加入适量缓冲液待测。为减少无关因素干扰，操作尽量在水浴中进行。
染色中应注意的事项：①细胞标本在整个过程中要尽量保持新鲜，采用有效措施防止表面抗原消失和细胞死亡；②荧光标记物用前应用滤膜或高速离心去除颗粒或沉渣以减少非特异性干扰；③细胞标本染色前应除死细胞；④为提高灵敏度可用三步间接染色法。
（3）免疫荧光标本的特殊处理：
①死细胞及碎片去除：样品中不可避免地存在着死细胞及碎片，影响分析结果。对于血细胞可用FCM通过0。 散射的差异不经染色而将死细胞分出弃除；对于培养细胞，由于其大小分布不均，可在样品内加少量PI染色后将死细胞去掉。一般情况下即可用仪器直接去除碎片，也可用血清沉降法去除大碎片，用离法去除小碎片。
②标本的保存和固定：实验中大多数样品在染色或分析前需要保存一定的时间，有时甚至需要进行固定。
未染色的新鲜标本贮存方法如下：10%二甲基亚砜，90%小牛血清，5×106～ 1×107 细胞在-70℃ 过夜，然后置液氮中可长期保存。
免疫染色未经固定的标本在4℃ 可保存48h。若需存放时间较长、或标本具有传染性，应该用固定剂固定。常用的固定剂配方是：1%～4%的多聚甲醛和PBS或0.8%的生理盐水配成p H7.2的固定液；或用0.37%～1.5%甲醛和PBS配成p H7.4的固定液。固定方法是：将经免疫荧光染色的细胞离心沉淀，再加入固定液混匀，放在4℃ 温度保存。一般来说，经固定处理的标本保存1周至2个月，多数样品的阳性细胞群体比例及荧光强度增色能保持在正常范围之内。
（4）主要检测的免疫指标：
①细胞毒试验：细胞毒是机体的一种免疫监督机制，细胞毒实验是一项重要的免疫指标。例如天然杀伤细胞NK（Natural killer）是一种引起免疫媒介的效应物，在抗肿瘤及感染因子的免疫监督系统中起着重要作用。研究表明，对NK细胞的测量可以做为免疫治疗监测的重要参数和有效的预后征状的指标。所使用的荧光探针为CFDA（Caboxy-fluorescein diacetate）。
②吞噬功能实验：单核吞噬细胞系统是机体的主要防御系统之一。FCM可以快速、定量地检查吞噬细胞的吞噬能力和速度。
③I型变变态反应的IgE受体细胞、IgE结合因子的检查。
④胞浆Ig及血清Ig分析，血小板表面的IgG测定，等等。
