免疫印迹法（immunobiotting test，IBT）

一． SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
基本原理是聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体acr聚合成长链并通过双功能化合物甲叉双丙烯酰胺Bis交联而成的三维网状结构凝胶。聚丙烯酰胺凝胶的机械性、弹性、透明度、粘着度取决于凝胶的总浓度，总浓度越大，平均孔径越小，机械强度越强。T是Acr与Bis的总百分浓度，C是Acr：Bis的重量百分比，T恒定，C为4%时，有效孔径最小，C大于或小于4%时，有效孔径均变大；C恒定，T增加，有效孔径降低。聚合过程由TEMED(四甲基乙二胺)和过硫酸铵激发。
阴离子去垢剂SDS能破坏蛋白质中的氢键和疏水键，按一定比例和蛋白质分子结合成复合物，使蛋白质带负电荷的量远远超过其本身原有的电荷量，掩盖了各种蛋白质分子间的天然电荷差异；加入巯基乙醇使电泳的迁移率不再爱原有分子形状的影响。蛋白质的迁移率将主要取决于其分子量的大小
基本步骤：
1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)
可以使用适当的裂解液，裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，用SDS上样缓冲液，裂解能力强，能提取细胞总蛋白，可用来检测多种蛋白，包括磷酸化蛋白。另外，常用的还有非离子去垢剂缓冲液裂解法，低渗缓冲液裂解法。可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提.
2.蛋白质浓度测定：
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。更方便的方法是选用成套的裂解液和定量试剂盒测定蛋白质。如果浓度过高，可按比例稀释，读出蛋白浓度后，再折算回原样品浓度。
3. 电泳(Electrophoresis)
配制SDS-PAGE凝胶，在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
注意：Acr和Bis单体对神经系统和皮肤有毒性作用，TEMED对粘膜和上呼吸道组织及皮肤有很大的破坏作用
4．电泳结果检查：
如果要做Western Blot，是否需要先检查电泳结果呢？能先看看结果如何再进行下一步转膜当然最好。考马斯亮蓝使用简便快速，可以分辨1ug左右的条带，是最经济通用的蛋白PAGE胶电泳染色方法。银染操作复杂一些但分辨率高很多，可以分辨2-5ng蛋白。可是由于考马斯亮蓝染色或者银染经过固定不可逆结合，会干扰后面的Western Blot实验，很多人会选择省略掉这一步——同样的样品跑2块胶，一块染色一块转膜，一般也可以说明问题。如果想在转膜前看看电泳结果，你需要用SYPRO Tangerine——这种金色荧光蛋白染料灵敏度很高——检测4ng-8ng蛋白，接近银染，但使用非常简单，最重要的是由于不用酸碱或者有机溶剂固定，不干扰蛋白活性，特别适合Western转膜前的染色，或者非变性胶的活性蛋白的检测（比如染色后还需要在胶上进行活性检测等等）。可惜SYPRO Tangerine价格挺贵的，500ul（5000x）要2000元，即使很节约的用只够大概100多次呢。所以最经济实惠的方法是：丽春红S，直接染色转移膜，检测转膜效果，充分脱色后不干扰Western结果。丽春红的检测灵敏度和考马斯亮蓝差不多。 免疫学实验技术论坛 http://bbs.bbioo.com/forum-140-1.html