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先加一抗后再封闭的话，一抗就会结合到固相表面上，这种结合力是非特异性的疏水作用力，这种作用力是比较强的，经过处理的固相表面如硝酸纤维膜，酶标板对蛋白的吸附力更强，你再去封闭就没有作用了。
当然，也不是说封闭蛋白就完全不会封闭掉一抗的蛋白结合位点，在蛋白过量的条件下，蛋白质之间会有黏附和堆积作用，但这种作用通常是不稳定的。
如果你所选择的一抗与固相抗原亲和力较高，在适合的buffer条件下，一抗会竞争它的结合位点。蛋白质之间那点黏附和堆积作用力当然竞争不过它啦。
下面是从书上摘下的几句话，希望对你有帮助：
" 组织中非抗原抗体反应出现的阳性染色称为非特异性背景染色，最常见的原因是蛋白吸附于高电荷的胶元和结缔组织成分上。最有效方法是在用第一抗体前加制备第 二抗体动物之非免疫血清(1:5~1:20) 封闭组织上带电荷基团而除去与第一抗体非特异性结合。必要时可加入 2%~5% 牛血清蛋白，可进一步减少非特异性染色。作用时间为 10~20min。 也可用除制备第一抗体以外的其它动物血清 (非免疫的)。有明显溶血的血清不能"
"对消除背景的非特异性染色有很好的效果。当然使用特异性高、效价高的
第一抗体是最重要的条件。"
"抗原-抗体是免疫球蛋白分子上的抗原结合簇与抗原分子上的抗原决定簇相互吸引以及多种分子间的引力参与发生的。这种反应没有化学键的形成。抗原-抗体的结合是可逆的“
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(责任编辑：大汉昆仑王)
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