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动物病毒的鸡胚培养法

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3014

实验五十 动物病毒的鸡胚培养法

  一、目的要求

  1.了解动物病毒鸡胚培养的意义及用途。

  2.初步掌握病毒鸡胚培养的基本方法。

  二、基本原理

  鸡胚培养法是用来培养某些对鸡胚敏感的动物病毒的一种培养方法,此方法可用以进行多种病毒的分离、培养,毒力的滴定,中和试验以及抗原和疫苗的制备等。

  鸡胚培养的技术比组织培养容易成功,也比接种动物的动物来源容易,无饲养管理及隔离等的特殊要求,且鸡胚一般无病毒隐性感染,同时它的敏感范围很广,多种病毒均能适应,因此,是常用的一种培养动物病毒的方法。

  各种病毒接种鸡胚均有其最适宜的途径,故应注意选择,见表Ⅻ-1。本实验用牛痘病毒(vaccinia virus)和鸡新城疫病毒(Newcastle-disease virus)接种鸡胚。牛痘病毒适宜于在绒毛尿囊膜上生长,经培养后,产生肉眼可见的白色痘疱样病变,似小结节或白色小片云翳状。鸡新城疫病毒适宜接种在尿囊腔和羊膜腔内,生长后,鸡胚全身皮肤出现出血点,以脑后最显著。

  三、器材

  牛痘病毒液,鸡新城疫病毒液;

  白壳受精卵(自产出后不超过10天,以5天以内的卵为最好);

  孵卵器,检卵灯,齿钻,磨壳器,钢针,蛋座木架,注射器,2.5%碘酒,70%酒精,镊子,剪刀,封蜡(固体石蜡加 1/4凡士林,溶化),灭菌培养皿,灭菌盖玻片等。

  四、操作步骤

  1.准备蛋胚

  孵育前的鸡卵先用清水以布洗净,再用干布擦干,放入孵卵器内进行孵育(37℃,相对湿度是45—60%),孵育三日后,鸡卵每日翻动1—2次。孵至第4日,用检卵灯观察鸡胚发育情况,未受精卵,只见模糊的卵黄黑影,不见鸡胚的形迹,这种鸡卵应淘汰。活胚可看到清晰的血管和鸡胚的暗影,比较大一些的可以看见胚动,随后每日观察一次,将胚动呆滞或没有运动的、血管昏暗模糊者,即可能是已死或将死的鸡胚,要随时加以淘汰。生长良好的蛋胚一直孵育到接种前,具体胚龄视所拟培养的病毒种类和接种途径而定。

  2.接种

  (1)绒毛尿囊膜接种

  (a)将孵育10—12天的蛋胚放在检卵灯上,用铅笔勾出气室与胚胎略近气室端的绒毛尿囊膜发育得好的地方。(b)用碘酒消毒气室顶端与绒毛尿囊膜记号处,并用磨壳器或齿钻在记号处的卵壳上磨开一三角形或正方形(每边约5—6mm)的小窗,不可弄破下面的壳膜。在气室顶端钻一小孔。

  (c)用小镊子轻轻揭去所开小窗处的卵壳,露出壳下的壳膜,在壳膜上滴一滴生理盐水,用针尖小心地划破壳膜,但注意切勿伤及紧贴在下面的绒毛屑囊膜,此时生理盐水自破口处流至绒毛屑囊膜,以利两膜分离。

  (d)用针尖刺破气室小孔处的壳膜,再用橡皮乳头吸出气室内的空气,使绒毛尿囊膜下陷而形成人工气室(图Ⅻ-4)。

  (e)用注射器通过窗口的壳膜窗孔滴 0.05— 0.1ml牛痘病毒液于绒毛尿囊膜上。

  (f)在卵壳的窗口周围涂上半凝固的石蜡,作成堤状,立即盖上消毒盖玻片。也可用揭下的卵壳封口,则将卵壳盖上,接缝处涂以石蜡,但石蜡不能过热,以免流入卵内。将鸡卵始终保持人工气室在上方的位置进行37℃培养,48—96小时观察结果。

  (2)尿囊腔接种

  用孵育10—12天的蛋胚,因这时尿囊液积存得最多。

  (a)将蛋胚在检卵灯上照视,用铅笔画出气室与胚胎位置,并在绒毛尿囊膜血管较少的地方作记号。

  (b)将蛋胚竖放在蛋座木架上,钝端向上。用碘酒消毒气室蛋壳,并用钢针在记号处钻一小孔。

  (c)用带18mm长针头的1ml注射器吸取鸡新城疫病毒液,针头刺入孔内,经绒毛尿囊膜入尿囊腔,注入0.1ml病毒液(图Ⅻ-5)。

  (d)用石蜡封孔后于37℃孵卵器孵育72小时。

  (3)羊膜腔接种

  (a)将孵育10—11天的蛋胚照视,画出气室范围,并在胚胎最靠近卵壳的一侧做记号。

  (b)用碘酒消毒气室部位的蛋壳。用齿钻在气室顶端磨一三角形,每边约1cm的裂痕。注意勿划破壳膜。

  (c)用灭菌镊子揭去蛋壳和壳膜,并滴加灭菌液体石蜡一滴于下层壳膜上,使其透明,以便观察,若将蛋胚放在检卵灯上,则看得更清楚。

  (d)用灭菌尖头镊子,两页井拢,刺穿下层壳膜和绒毛尿囊膜没有血管的地方,并夹住羊膜从刚才穿孔处拉出来(图Ⅻ-6)。

  (e)左手用另一把无齿镊子夹住拉出的羊膜,右手持带有26号针头的注射器,刺入羊膜腔内,注入鸡新城疫病毒液 0.1ml。针头最好用无斜削尖端的钝头,以免刺伤胚胎。

  (f)用绒毛尿囊膜接种法的封闭方法将卵壳的小窗封住,于37℃孵卵器内孵育48—72小时,保持蛋胚的钝端朝上。

  3.收获

  (1)绒毛尿囊膜

  (a)用碘酒消毒人工气室上的卵壳,去除窗孔上的盖子。

  (b)将灭菌剪子插入窗内,沿人工气室的界限剪去壳膜,露出绒毛尿囊膜,再用灭菌眼科镊子将膜正中夹起,用剪刀沿人工气室边缘将膜剪下,放入加有灭菌生理盐水的培养皿内,观察病灶形状。然后或用于传代,或用50%甘油保存。

  (2)尿囊腔接种法收获尿囊液

  (a)将蛋胚放在冰箱内冷冻半日或一夜,使血管收缩,以便得到无胎血的纯尿囊液。

  (b)用碘酒消毒气室处的卵壳,并用灭菌剪刀除去气室的卵壳。切开壳膜及其下面的绒毛尿囊膜,翻开到卵壳边上。

  (c)将鸡卵倾向一侧,用灭菌吸管吸出尿囊液。一个蛋胚约可收获6ml左右尿囊液。若操作时损伤了血管,则病毒会吸附在红细胞上,尿囊液成为无用。收获的尿囊液经无菌试验后可在4℃以下的温度中保存。

  (d)观察鸡胚,看有无典型的症状。

  (3)羊膜腔接种法收获羊水

  (a)按收获尿囊液的方法消毒、去壳,翻开壳膜和尿囊膜。(b)先吸出尿囊液。

  (c)再用镊子夹出羊膜,以尖头毛细吸管插入羊膜腔,吸出羊水,放入灭菌试管内,每蛋胚可吸0.5—1.0ml。经无菌试验后,保存于低温中。

  (d)观察鸡胚的症状。

  五、实验报告

  1.结果

  (1)描写牛痘病毒在绒毛尿囊膜上培养后,所出现的病变状况。

  (2)描写鸡新城疫病毒接种鸡胚培养后,鸡胚所出现的变化。

  2.思考题

  本实验所用的两种病毒,除能在鸡胚中进行培养外,还能用哪些方法进行培养?试比较它们的优缺点。

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