光镜免疫金银细胞化学方法

光镜免疫金银细胞化学方法

一、免疫金染色

（一）免疫金法（IGS）

1987年，Geoghegan等首次应用免疫金探针检测B淋巴细胞表面抗原，建立了用于光镜水平的免疫金法（Immunogold staining, IGS）。IGS的特点是染色程序简便，不要显色，就能检测细胞表面的抗原，又能检测细胞内抗原。染色时免疫金法一般要求金颗粒的直径大于20nm，并且用的浓度较高。用IGS定位细胞抗原时一般都采用间接法，下面以人肝组织HBsAg的定位为例说明IGS的步骤：

（1）石蜡切片→脱蜡至水。

（2）0.1%胰蛋白酶消化10min或3mon/L尿素消化30min。

（3）用双蒸水振洗5＇×2。

（4）用0.02mol/l TBS pH8.2振洗10＇×2。

（5）1%卵蛋白（EA）封闭10min。

　　（6）稀释鼠抗HBsAg单克隆抗体（用0.02mol/l TBS pH8.2 作1：100稀释），4 ^℃ 过夜。

（7）0.02mol/l TBS pH8.2振洗10＇×2。

（8）1%EA封闭10min。

（9）0.02mol/l TBS pH8.2 稀释兔抗鼠金标抗体（1：8）37℃45min。

（10）0.02mol/l TBS pH8.2振洗10＇×2。

（11）双蒸水振洗5＇×2。

（12）1%戊二醛，10min。

（13）双蒸水5min 。

（14）用苏木素衬染核1min，甘油封片。

结果：在光镜下可见部分肝细胞浆内有金颗粒聚集呈红色，沿细胞膜分布，表明有HBsAg定位在细胞浆内。

（二）蛋白A-金（PAG）放大法

为了得到更明确的染色结果，在用IGS方法定位细胞抗原时可采用搭桥法，使IGS得到放大，这里介绍一种用抗A蛋白抗体作桥的PAG放大法。下面以5-羟色胺定位为例说明这一新方法。

（1）石蜡切片→脱蜡至水。

（2）1%胰蛋白酶消化10min或3mon/L尿素消化30min。

（3）0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5＇×2。

（4）1%EA封闭组织10min。

（5）用0.05mol/l pH7.4 TBS 稀释兔抗5-羟色胺抗体（1：1000）4℃过夜，或者37℃1h。

（6）0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5＇×2。

（7）1%EA封闭10min。

　　（8）用0.05mol/l pH7.4 TBS 稀释PAG（1：40），37 ^℃ 1h。

（9）0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10＇×2。

（10）1%EA封闭10min。

　　（11）抗A蛋白抗体（1：100）37 ^℃。 45min。

（12）0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10＇×2。

（13）加0.05mol/l pH7.4 TBS稀释PAG（1：40），37℃45min。

（14）0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10＇×2。

（15）双蒸水振洗5min。

（16）1%戊二醛10min。

（17）双蒸水振洗5min。

（18）0.01%伊文思蓝2min，甘油封片。

光镜下观察，小肠粘膜内含有嗜银颗粒的细胞胞浆呈红色，阳性颗粒位于细胞核底部，比单纯用PAG染色深度得到加深，阳性结果得到放大。由于抗A蛋白抗体既能通过Fab段又能够通过Fc段与PAG上的A蛋白结合，因此，与其它桥抗体相比它能够在抗原位点处聚集更多的胶体金颗粒。基本原理如下图5-3。

　　PAG放大法的优点：①使用 试剂 单一；②可大大提高IGS的敏感性，从而使应用IGS方法定位抗原时使用高稀释度的抗体成为可能；③背景干净。可以预见这一新方法将很快受到人们的关注。

二、免疫金银法

　　1983年，Holgate等人将IGS与银显影方法相结合创立了免疫金银法（Immunogold―sliver staining, IGSS）IGSS的基本原理是通过免疫反应沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对苯二酚还原剂将银离子（Ag ⁺ ）还原成银原子（Ag ^o ）。被还原的银原子于是围绕金颗粒形成一个“银壳”，“银壳”一旦形成本身亦具有催化作用，从而使更多银离子还原并促使“银壳”越长越大“，最终抗原位置得到清楚放大。

（1）切片常规脱蜡至水。

（2）Lugol＇s液，5min.

（3）5%硫代硫酸钠水溶液脱碘5min。

（4）用双蒸馏水冲洗干净。

（5）0.05mol/l pH7.4 TBS洗5min两次。

（6）用0.1%胰蛋白酶消化10min或用3mol/L尿素消化20min。

（7）0.05mol/l pH7.4 TBS洗5min一次。

（8）1%卵白蛋白封闭15min。

　　（9）马抗HBsAg抗体1：1000稀释，37 ^℃ 1～2h 或4℃过夜。

（10）0.05mol/l pH7.4 TBS洗5min两次。

（11）1%卵白蛋白封闭10min。

（12）1：40，PAG，37℃45min。

（13）0.05mol/l pH7.4 TBS洗5min两次。

（14）双蒸水洗5min，两次。

（15）物理显影见后所述。

（16）双蒸水洗5min，两次。

（17）苏木素衬染。

（18）酒精常规脱水，透明，封固。

结果，光镜下见肝细胞胞浆内有膜或包涵体形分布的阳性黑色状颗粒，背景干净。

（二）冰冻切片的IGSS染色

作冰冻切片的组织，若在动物试验可以先经过固定液灌注或浸泡固定，也可不固定先做冰冻切片。人的组织也可通过浸泡固定或不固定，这主要根据保存抗原性的需要而定。固定过的组织可用20%蔗糖PBS（0.01mol/l pH7.2）浸泡2～4h或在切片时用OCT包埋，以减少冰冻切片过程中冰晶的形成。如果切片还准备用于电镜包埋，则可经过5%，10%，20%浓度逐级递增的蔗糖溶液。在冰冻切片前，可先入氟里昂�22 （Freon--22）骤冷，这样可使组织的结构保存更好，适用于电镜观察。

（1）冰冻切片。

（2）Lugol＇s液，5min.

以下步骤同人肝HBsAg的染色方法。

（三）半薄切片的IGSS染色

IGSS染色的半薄切片，可以在光镜下直接观察阳性结果，为电镱取阳性部位及观察打下良好的基础。