核酸分子杂交技术概述-- 核酸的分子结构
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第十八章 核酸分子杂交技术概述
第一节 核酸的分子结构
一、核酸的化学组成
组成核酸的元素有C、H、O、N、P等，其中N含量约为15%～16%，磷含量为9%～10%。由于核酸分子中的磷含量比较恒定，因此，核酸定量测定的经典方法，是以测定磷含量代表核酸量。
核酸经水解可得到多核苷核，因此核苷酸是核酸的基本单位，核酸就是由很多单核苷酸聚合形成的多核苷酸，核苷酸可被水解产生核苷和磷酸，核苷还可进一步水解，产生戊糖和含氮碱。因此，核酸是由含氮碱、戊糖及磷酸三种成分组成。
含氮碱（简称碱基）：核酸中的含氮碱简称碱基，是嘌呤碱（purine）与嘧啶碱（pyrimidine）的衍生物。RNA和DNA含有的共同碱基成分是腺嘌呤（adenine,A）、鸟嘌呤（guanine,G）和胞嘧啶（cytosine, C）。二者的区别是RNA含有尿嘧啶（uracil,U），而DNA含有胸腺嘧啶（thymine,T）。嘌呤和嘧啶都有酮-烯醇式互变异构现象，一般生理pH条件下呈酮式。它们的结构如下：
有些核酸中含有修饰碱基（或稀有碱基），这些碱基大多是在上述嘌呤或嘧啶碱的不同部位甲基化（methylation）或进行其它的化学修饰而形成的衍生物。例如有些DNA分子中含有5-甲基胞嘧啶（m 5 C），5-羟甲基胞嘧啶（hm 5 C）。某些RNA分子中含有1-甲基腺嘌呤（m 1 A）、2，2-二甲基鸟嘌呤（m 2 2 G）和5，6-二氢尿嘧啶（DHU）等。
嘌呤碱和嘧啶碱一般多不易溶于水，对250～280nm波长的紫外光有较强的吸收，但对260nm光波的吸收能力最大。由于碱基是核酸的基本组成成分，因此，所有的核酸（包括DNA和RNA）其共同特点是对260nm处的紫外光有最大的吸收值。
核酸分子中碱基的克分子数与磷的克原子数相等，所以可根据核酸溶液中的磷含量及紫外光的吸收值来测定核酸量。一般以每升核酸溶液中含1g磷原子为标准来计算核酸的吸光率，这称为克原子磷吸光率或克原子磷消光系数[ε（p）],ε(p)的计算式为：
ε（p）=A/Cl
A为吸光度（光密度），1为比色杯内径，通常为1.0cm；C为每升核酸溶液中磷的克原子数。
C= 每升溶液中磷重（wg）/30.98 ε(p)=30.98A/wl
一般DNA的ε（p）=6000～8000;RNA为7000～10000
现将DNA和RNA的化学组成归纳如表18-1：
表18-1
RNA
DNA
嘌呤碱
腺嘌呤鸟嘌呤
腺嘌呤鸟嘌呤
嘧啶碱
胞嘧啶尿嘧啶
胞嘧啶胸腺嘧啶（或5-甲基胞嘧啶）
戊糖
核糖
脱氧核糖
磷酸
磷酸
磷酸
二、核酸的一级结构
核酸又称多核苷酸，组成DNA的脱氧核糖核苷酸主要为四种，即dAMP、dGMP、dCMP及dTMP；组成RNA的核糖核苷酸主要有AMP、GMP、CMP及UMP四种。对两种核酸的组成可简写如下：
DNA=（碱基-脱氧核糖-磷酸）n；RNA=（碱基-核糖-磷酸）n
核酸中核苷酸的连接方式为：一个核苷核C-3’上羟基与下一个核苷核酸C-5’连接在磷酸羟基脱水缩合成酯键，称酯键称3’5’磷酸二酯键，若干个核苷酸间依3’5’磷酸二酯键连接成长链的大分子即为核酸。此长链称多核苷酸链，在链的一核苷酸，其C-5’连接的磷酸只一个酯键，称此核苷酸为链的5’磷酸未端或5’。链的另一端核苷酸上C-3’上羟基是自由的，对此核苷酸称为3’羟基末端或3’端，链内的核苷酸在C-5’上磷酸已形成二酯键，C-3’上羟基也已参与二酯键的形成，故称核苷酸残基。
核酸的一级结构乃指其核苷酸链中核苷酸的排列顺序，由于核酸中核苷酸彼此之间的差别乃在于碱基部分，故核酸的一级结构即指核酸分子中碱基的排列顺序。
对核酸一级结构的描述为：将5’磷酸末端书于左侧，中间部分为核苷酸残基，3’羟基末端书于右侧。通常用竖线表示核糖，碱基标于竖线上端，竖线间有含P的斜线，代表3’,5’磷酸二酯键。此表示法及简化式如下：
三、核酸的高级结构
核酸的多核苷酸链在次级键的基础上，还可形成更为复杂的二级及三级的高级结构。
（一）DNA
1．二级结构1953年Watson 及Crick在化学分析及X光衍射法观察DNA结构的基础上提出了著名的DNA双螺旋结构模型（double helix model）此结构是在核酸一级结构基础上形成的更为复杂的高级结构，即DNA的二级结构，结构如图18-1。
图18－1 DNA的双螺旋结构
P：磷酸基；S：脱氧核糖；G：鸟嘌呤；
A：腺嘌呤；T：胸腺嘧啶C：胞嘧啶
DNA的二级结构即双螺旋结构，其内容可归纳为：
（1）DNA分子为二条多核苷酸链以一共同轴为中心，盘绕成右手双螺旋结构。螺旋直径2nm。螺旋盘绕形成链间的两种沟，即宽的大沟与狭窄的小沟。
（2）二条多核苷酸链的走向相反，通常取左侧链从上到下为5’→3’端，右则链从下向上为5’→3’端，这样二条链构成反平行排列的双螺旋。
（3）二条多核苷酸链借氢键而连系在一起。氢键乃一链碱基上-NH 2 的氢与另一链上碱基的氧或氮形成。碱基有二个氢键，G与C之间有三个氢键（图18-3）。这种相配关系称为碱基互补或碱基配对。配对的碱基处于同一平面，此平面与双螺旋的中心轴垂直，由于二条链中碱基互补，所以二链彼此又称为互补链。
（4）碱基对之间氢键的能量为3～7kcal/mol，由于氢键多，所以可维系DNA双链结构。另外碱基对彼此间距离为0.34nm,每一螺旋含10个碱基对，故螺距为3.4nm，相邻碱基对间彼此尚有范德瓦士（van der Waals）力作用（此力量为1～2kcal/mol,作用范围为0.5nm），能量虽弱但由于碱基对多，合力也就大。可见碱基对的氢键及碱基对之间的范德瓦士力是稳定DNA成双螺旋结构的主要能量。
上述DNA的双螺旋结构是溶液及活体中常见的形式，通称B型。当B型所处条件的湿度低于75%时，可转变为A型。A型的碱基对不垂直于双螺旋的轴、倾斜约20度，螺距降为2.8nm，每一螺旋含11个碱基对。B型与A型的水合程度不同，它们是DNA分子在天然条件下的两种基本形式。除A、B型外尚发出有C型双螺旋，似B型，螺距3.3nm，第一螺旋含9个碱基对。
DNA双螺旋结构阐明的量重要意义在于第一次提出了遗传信息是以DNA分子中核苷酸的排列顺序为储存方式，从而说明了天然遗传信息的复制过程。
2．三级结构已发现线粒体、叶绿体、细菌、质粒及一些病毒的DNA双螺旋分子尚可形成封闭环状，天然状态的环状DNA分子多扭曲成麻花状的超螺旋结构（superhelix），这些比螺旋更为复杂的结构即DNA分子的三级结构。
真核生理细胞核中的DNA具有一种超螺旋结构，即DNA双螺旋盘绕在组蛋白上形成核小体（nucleosome）。核小体是染色质（chromatin）的核心小粒，由有140个碱基对的双螺旋DNA缠绕于由组蛋白（H2A、H2B、H3及H4各二分子）组成的八聚体外面，这一DNA股由此形成直径为9nm的超螺旋1.75圈。此核小体又经60个碱基对的DNA双螺旋及组蛋白H1形成细丝（间隔区）与下一个核小体相连接。
核小体的DNA双螺旋为200个碱基对，长度应为0.34nm×200=68nm，但实际长度只10nm，说明DNA双螺旋链进一步螺旋化盘绕在组蛋白八聚体上，其长度压缩了7/8。每6个核小体又绕成一圈形成螺线管，外径为30nm，螺距为10nm。这样DNA分子长
