大鼠抵抗素(Resistin)ELISA试剂盒

互联网2013-09-06

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大鼠抵抗素 (Resistin)ELISA 试剂盒

( 用于血清、血浆、细胞培养上清液和其它生物体液内 )

原理

本实验采用双抗体夹心 ABC-ELISA 法。用抗大鼠 Resistin 单抗包被于酶标板上，标准品和样品中的 Resistin 与单抗结合，加入生物素化的抗大鼠 Resistin ，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化物酶标记的 Streptavidin 与生物素结合，加入底物工作液显蓝色，最后加终止液硫酸，在 450nm 处测 OD 值， Resistin 浓度与 OD 值成正比，可通过绘制标准曲线求出标本中 Resistin 浓度。

试剂盒组成 （ 2<chmetcnv>-8℃ </chmetcnv> 保存）

酶标板（ Coated Wells ）	96 孔	酶标抗体工作液（ Enzyme Conjugate ）	12ml
10 ×标本稀释液（ Sample Buffer ）	12ml	20 ×浓缩洗涤液（ Wash Buffer ）	50ml
标准品（ Standards ）： 8ng/ 瓶	2 瓶	底物工作液（ TMB Solution ）	12ml
第一抗体工作液（ Biotinylated Antibody ）	12ml	终止液（ Stop Solution ）	12ml

准备试剂与收集血样

1. 收集标本：血清、血浆（ EDTA 、肝素抗凝）、细胞培养上清液、组织匀浆等尽早检测， 2<chmetcnv>-8℃ </chmetcnv> 保存 48 小时；更长时间须冷冻（ <chmetcnv>-20 ℃ </chmetcnv>或 <chmetcnv>-70 ℃ </chmetcnv>）保存，避免反复冻融。正常标本测定前用标本稀释液作 1 ： 10 稀释（取 20ul ，加标本稀释液 180ul, 稀释 10 倍）。

2. 标准品液配制：使用前加入 2ml 蒸馏水混匀，配成 4000pg/ml 的溶液。设标准管 8 管，每管加入标本稀释液 300ul 。在第一管中加入 4000pg/ml 的标准品溶液 300ul 混匀后用加样器吸出 300ul ，移至第二管。如此反复作对倍稀释，从第七管中吸出 300ul 弃去。第八管为空白对照。

3. 10 ×标本稀释液用蒸馏水作 1:10 倍稀释（示例： 1ml 浓稀释液 +9ml 蒸馏水）。

4. 洗涤液：用重蒸水 1:20 稀释（示例： 1ml 浓缩洗涤液加入 19ml 的重蒸水）

检测程序

1. 加样：每孔各加入标准品或待测样品 100ul ，将反应板充分混匀后置 <chmetcnv>37 ℃ </chmetcnv>120 分钟。

2. 洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤 4-6 次，向滤纸上印干。

3. 每孔中加入第一抗体工作液 100ul 。将反应板充分混匀后置 <chmetcnv>37 ℃ </chmetcnv>60 分钟。

4. 洗板：同前。

5. 每孔加酶标抗体工作液 100ul 。将反应板置 <chmetcnv>37 ℃ </chmetcnv>30 分钟。

6. 洗板：同前。

7. 每孔加入底物工作液 100ul ，置 <chmetcnv>37 ℃ </chmetcnv>暗处反应 15 分钟。

8. 每孔加入 100ul 终止液混匀。

9. 30 分钟内用酶标仪在 45 0nm 处测吸光值。

结果计算与判断

1. 所有 OD 值都应减除空白值后再行计算。

2. 以标准品 2000 、 1000 、 500 、 250 、 125 、 62.5 、 31.2 、 0 pg/ml 为横坐标， OD 值为纵坐标，在坐标纸上作图，画出标准曲线。

3. 根据样品 OD 值在该曲线图上查出相应 Resistin 含量，再乘上稀释倍数 10 即可。

试剂盒性能

1. 灵敏度：最小的 Resistin 检测浓度小于 15pg/ml 。

2. 特异性：可同时检测重组或天然的大鼠 Resistin 。不与大鼠其它细胞因子有交叉反应。

3. 重复性：板内、板见变异系数均小于10 ％。

注意事项

1. 以上标准孔及待测样品均建议做复孔，每次测定应同时做标准曲线。

2. 洗涤过程很关键。洗涤不充分将导致精确度误差及 OD 值错误地升高。

3. 板条开封后剩余板条要再封好，保持板条干燥 。

4. 本试剂盒宜置 4^o C 冰箱保存。

5. 本试剂盒仅用于科研，不能用于临床诊断！