限制性片段长度多态性（RFLP）分析

限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）分析技术是分子生物学的重要分析方法之一，用于检测DNA序列多态性。PCR-RFLP 是将PCR 技术、RFLP 分析与电泳方法联合应用，先将待测的靶DNA 片段进行复制扩增，然后应用DNA 限制性内切酶对扩增产物进行酶切，最后经电泳分析靶DNA 片段是否被切割而分型。

本实验将应用RFLP 分析技术检测NMDA 受体中的GRIN2A 亚基基因3 号内含子中的2 个SNP 位点rs17750303（A→C）和rs837690（A→G）。

[实验原理]

DNA 限制性内切酶具有识别特定的DNA 序列并在特定的部位切断DNA 双链的活性功能，DNA 分子由于突变（核苷酸的置换、插入或缺失）改变（或形成）了限制性内切酶识别序列，使DNA 限制性内切酶不能（或可以）将靶DNA 片段切断，电泳检测时，存在相应DNA 限制性内切酶识别序列者原DNA 片段变成短片段；不存在相应DNA 限制性内切酶识别序列者原DNA 片段长度将不发生变化。

[实验器材]

PCR 扩增仪、电泳仪、电泳槽、微波炉、恒温箱或恒温水浴等。

[实验试剂]

限制性内切酶BstNI、模板DNA、Taq聚合酶、PCR引物（上游引物:5－CTAAGCCTTCCCTTTATCACC－3’；下游引物：5－TTCACAGTCGTGCTTGTTTCT－3’）、丙烯酰胺、酶消化缓冲液、电极缓冲液、上样缓冲液等。

[实验方法]

1.PCR扩增：PCR反应体系为20μl，含模板2μl(约50ng)，引物各1.6μl，dNTP1.6μl(0.4mM)，10×Buffer缓冲液2μl，Taq酶0.5U，加双蒸水至20.0μl；PCR反应条件为95℃2min，94℃30sec/64℃30sec/72℃30sec(5个循环)，94℃30sec/63℃30sec/72℃30sec(5个循环)，94℃30sec/60℃30sec/72℃25sec(23个循环)，94℃30sec/60℃30sec/72℃1min。

2.PCR 扩增产物的检测：取PCR 扩增产物2μl，以1%的琼脂糖凝胶潜水电泳法检测靶DNA 片段的扩增产物。

3.酶消化反应：取PCR 产物约2.0μl，加限制性内切酶BstN I1U，10×酶消化反应缓冲液1.0μl，蒸溜水补至10.0μl 置试验管中。37℃温箱中孵育4h。

4.酶切产物电泳分型：6%聚丙烯酰胺凝胶电泳（T=6%，C=3.3%，凝胶规格为82mm×64mm×0.75mm）。电极缓冲液为1×TBE。将加有1/5 体积上样缓冲液的酶切产物电泳，220 v 电压，电泳2－3h。

5.银染显色将凝胶剥离至染色盘中，用10%冰醋酸固定30min,去除固定液，用蒸馏水冲洗凝胶3 次（2min 以内）。将0.1%硝酸银溶液200ml 倒入染色盘中，染色30min，倒掉染色液，蒸馏水快速冲洗凝胶1 次（20s 以内）。显色液200ml（3% Na2CO3，含0.05%甲醛，2‰Na2S2O3）倒入染色盘中，不断震荡，直至谱带显示清晰。用固定液终止显色。蒸馏水洗涤一次，贴于滤纸上晾干保存。

[结果判定]

本实验PCR 产物长度为379bp，rs17750303 位点位于140bp 处，为A/C突变。rs837690 位点位于175bp 处，为AG 突变。两个位点均为BstN I 酶识别部位，酶切后可以产生1-4（6 种）个DNA 片断，根据酶切片段数量与长度可出现10 种谱型（基因型组）见下表。

根据酶切片段数量与长度确定rs17750303－rs837690 位点基因型组合

GRIN2A 基因rs17750303 与rs837690 位点的RFLP 电泳谱型

1.DNA 长度标准品；2.PCR 扩增产物；3.AA-AA 型；4.CC-AG 型；5.AC-AA型,；6.AC-GG 型，；7.CC-AA 型；8.CC-GG 型；9.AA-GG 型；10.CA-AG 型。

[实验讨论]

1.注意事项 ①靶片段的扩增产物要纯，如有非特异产物（特别是大片段可能含有酶识别序列）将竞争酶活性，使样品消化不完全或及出现酶消化杂带；②酶消化过程要充分（即底物与酶的比例要合适，消化时间要保证），避免假阴性结果；③酶切阳性结果可以确定所检测具体序列，阴性结果仅可说明非酶识别序列，但不能准确判定具体序列。④酶识别序列如有甲基化之核苷酸将不被切割。

2.方法评价 该方法操作简单，结果容易判定。