PCR产物的电泳鉴定

一、准备工作

1、实验器具与材料：

（1）移液枪：10ul

（2）吸头：20ul

（3）吸头台：放置200ul和20ul的吸头一个

（4）三角烧瓶：50ml一个

（5）琼脂糖

2、实验器具的处理与准备

（1） 塑料制品：（包括吸头等）

送至高压3次，试验前将枪头放入吸头台。

（2）电泳板及电泳槽：

用自来水冲洗干净备用

3、试剂配制和准备：

（1） 电泳缓冲液（TAE）：

先配制0.5mol/L，PH8.0的EDTA溶液：将37.2g EDTA-Na加入160ml蒸馏水中，在搅拌器上剧烈搅拌。在用NaOH调节溶液PH值至8.0（约需4gNaOH）。用蒸馏水定容至200ml。后送至高压灭菌。室温保存。

再配制50×TAE溶液：在400ml蒸馏水中溶解121g Tris碱，加入28.55ml冰乙酸和50ml 0.5ml/L EDTA溶液，再加蒸馏水定容至500ml，室温保存。

（2）琼脂糖溶液（1.0%）：

50×TAE溶液取10ml，稀释成500ml，取50ml溶解0.5g琼脂糖，电炉上煮至沸腾，溶化的琼脂物冷却至60℃左右时加入10mg/ml EB 5ul，充分混匀，将温热的凝胶倒入已置好梳子的电泳板中，在室温下放置45min左右后进行电泳。

（3）溴化乙锭（EB）（10mg/ml）：

在20ml水中加入0.2g溴化乙锭，磁力搅拌数小时。然后用铝箔包裹容器或将溶液转移至棕色瓶中，室温保存。

（4）加样缓冲液（Loading Buffer）一般为6×Loading Buffer

二、电泳鉴定时注意事项：

佩戴一次性手套，避免皮肤接触EB。无路做胶还是电泳缓冲液尽量用新的，不要超过两周。

三、电泳步骤

1、50×TAE取10ml稀释成500ml，取50ml溶解0.5g琼脂糖。电炉上煮沸后加入EB 5ul。另外450ml TAE倒入电泳槽中。

2、用透明胶封闭电泳板，琼脂糖溶液冷却至温热时，倒入带梳子的电泳板中，冷却后，拔出梳子，放入电泳槽中。

3、加样：PCR Marker：1ul Marker+1ul Loading Buffer+4ul TAE混匀于塑料膜上，加入孔中。PCR样品：5ul 样品DNA+1ul Loading Buffer 混匀后依次加入孔中。

4、接上电源，电压120V，电流50mA进行电泳。

5、电泳约1小时后，紫外灯检测。