组织芯片制备的技术路线和基本制作过程

组织芯片制备的技术路线和基本制作过程：

通过组织芯片制作机细针打孔的方法，从众多的组织蜡块（称为供体蜡块，donor）中采集到数十至上百的圆柱形小组织（组织芯，tissue core），并将其整齐排列另一空白蜡块（称为受体蜡块，recipient）中，而制成组织芯片蜡块。然后对组织芯片蜡块进行切片，再将切片转移到载玻片上制成组织芯片。

1.芯片微陈列设计：在构建组织芯片之前，应该预先计划检测多少样本，然后相应地进行设计。对大多数研究来说，在一个常规的载玻片上放置60~100个样本已经足够了。当样本超过100例时，上样、切片、染色及研究各个步骤都要求相当熟练，并且由于样本排列过于紧密，有可能导致芯片制作和研究失败。因此在计划检测数百个到上千标本时可考虑多做几个组织芯片。

2.收集病例及相关蜡块：挑选出具有随访资料的不同发展阶段的肿瘤组织蜡块，根据HE切片对石蜡标本中有代表性的点进行标记，包括典型的肿瘤和相应的正常组织，以构建肿瘤组织芯片。

3.TMA受体蜡块制备：取97.5克莱卡石蜡+2.5克蜂蜡（2.5%）混合，制成长36mundefined宽26mundefined高17mm的空白蜡块，在该蜡块20mm×16mm范围内设计10×8点组织陈列。组织四周预留0.5cm-0.7cm空间，用组织仪打孔制成TMA蜡块。

4.在组织芯片制作机上用细针对受体蜡块打孔，孔径以1~1.5mm比较适宜。

5.同样在供体蜡块上标记的相应部位打孔采集组织芯。孔径同样为1~1.5mm。

6.将组织芯转移到受体模块的孔中，每个组织芯之间的间距以0.2mm为佳。

7.为了防止在打点、切片、染色或免疫组化过程中出现漏点，滑片及掉片现象，每个样本可以上样1-2个点。

8.将构建好的TMA芯片蜡块放在相宜的塑料盒子内，并严密固定防止移位。放入55℃温箱中约10分钟，在蜡将要完全溶解前，取出室温下冷却，使受体模块的蜡与新插入的小圆柱状组织溶为一体，取下蜡块，于4℃冰箱中保存备用。

9.切片前，蜡块需在4℃中预冷4h左右，然后夹在切片机上进行修正，等修到全部组织完整为止。用-20℃预冷冰袋贴在蜡块上5-10min左右，快速连续切片30-50张左右，再用冰袋冷冻组织块，或直接在冰冻切片机内进行，直至将组织切完为止。将4μm连续切片分别漂在凉水中，让其自然展开，按顺序将切片转移至45℃的温水中展片2min左右，将其贴在浸有APES切片黏合剂的载玻片上晾干，60℃中烤片3min左右，58℃中继续烤片18h，-20℃保存备用。

组织芯片制备的技术关键

1.从供体蜡块中采集组织芯时，由于外检蜡块采用普通石蜡，其韧性差、质地硬容易碎裂和使打孔针弯曲，所以要细心、耐心地采集组织芯，并可以将外检蜡块在37℃预热后再采集。

2. 构建好的TMA芯片中，要使组织芯和受体蜡块融合成一体，需要在55℃温箱加温。此时温度、时间调控十分重要，既要使组织芯不易掉片、滑片，又要防止受体蜡块融化移动组织芯位置。

3.载玻片的清洁和防止掉片处理亦是制作切片的关键不能忽视。

组织芯片受体蜡块设计

备注：在第1行第1孔不需要取出石蜡芯，仅留记号作为芯片的起点标志。