Native-PAGE的基本分类

有三种常用的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法：blue native（BN-PAGE），clear native（CN-PAGE），quantitative preparative native continuous（QPNC-PAGE）。

在一个典型的native PAGE方法中，复合物被CN-PAGE或BN-PAGE分离。然后可以用其它分离方法如SDS-PAGE或等电聚焦做进一步分离。随后切割凝胶，蛋白复合物每一个部分都被分开。蛋白的每个条带可以消化后做肽链指纹图谱或重新测序。这样就可以提供一个蛋白复合物中单个蛋白的重要信息。

一、Blue Native PAGE

Blue Native PAGE是最古老的Native-PAGE技术。是以考马斯亮蓝作为电泳分离后蛋白质鉴定染料的一种电泳方法。这种方法的缺点是：考马斯亮蓝与蛋白的结合起到了去垢剂的作用，可能导致复合物的分离；并对化学发光或蛋白质辅基的荧光或荧光染料的标记具有潜在的猝灭作用。

Blue Native PAGE在分析蛋白质-蛋白质相互作用以及膜蛋白复合物方面有很大的优势，其分离范围在100KDa-10MDa。在Blue native PAGE过程中，最重要的化合物就是考马斯亮蓝，除了增溶作用以外，蛋白质表面结合了大量的考马斯亮蓝染料而带上负电荷，这会导致即使碱性蛋白在 pH7.5条件下也会向阴极迁移。但是，蛋白质虽然带有大量的负电荷，然而其分离依据的根本还是根据不连续的凝胶梯度-凝胶孔径的逐渐减小，蛋白质最终迁移到其自身大小与凝胶孔径相近似的位置而停止。并且在分离膜蛋白的过程中，由于带有负电荷，而不会引起蛋白聚合，与酸性染料的结合，膜蛋白也由疏水性变成亲水性，溶解性大大提高。

二、Clear Native PAGE

Clear Native PAGE是通过除染色以的其它方法如SLS鉴定蛋白的电泳技术。然而，这种方法最大的应用还是研究蛋白质-蛋白质相互作用，特别是和质谱联用。

Clear Native PAGE是在聚丙烯酰胺凝胶中分离酸性水溶性蛋白和膜蛋白（PI<7）的电泳技术，分辨率通常比BN-PAGE低。迁移距离决定于蛋白的固有电荷和凝胶孔径大小。因此，BN-PAGE比CN-PAGE应用更广泛。然而CN-PAGE在考马斯染料分析天然混合物干扰进一步分析时存在着优势。如测定催化活性（例如线粒体ATP合酶）或分离用于荧光共振能量分析的微量膜蛋白，CN-PAGE比BN-PAGE更温和，特别是使用洋地黄皂苷时，CN-PAGE 可以保持膜蛋白的超分子组合体的结构而BN-PAGE会导致分解。线粒体ATP合酶中的具有酶活性的低聚物可以用CN-PAGE检出，但BN-PAGE无法检出。

CN-PAGE起源于无色非变性PAGE，是BN- PAGE之后出现的技术。既然CN-PAGE中没有带电荷的染料，蛋白在电场中的迁移完全取决于这个蛋白的固有电荷。大分子和低聚蛋白必须有合适的物理参数才能在CN-PAGE中分开，特别是PI低于5.4，分辨率低。由此看来，CN-PAGE除了获得未染色的蛋白以外在分析膜蛋白中没有什么优势了。优点是条件更温和，在蛋白质组学研究中具有更大优势。BN-PAGE和CN-PAGE的缓冲液和电泳条件一致，但是CN-PAGE的阴极缓冲液中不含考马斯染料，而是将0.025%的洋地黄皂苷加入到凝胶中。

三、QPNC-PAGE

QPNC-PAGE（quantitative preparative native continuous polyacrylamide gel electrophoresis）是一种应用于生物化学和生物有机化学的根据等电点分离蛋白的高分辨技术。这种凝胶电泳被生物学家应用于独立活性或天然金属蛋白样品或正确或非正确折叠的可溶性的与金属辅助因子结合的蛋白混合物的鉴定。

1. 电泳缓冲液

QPNC-PAGE是在特殊的装置里进行的分离生物活性分子的电泳过程。在特殊的电泳缓冲系统（基于Tris-HCl和NaN3）中，一个生物系统中的大多数蛋白都会带电荷，在电场的正负极之间迁移。

尽管PH（10.00）的电泳缓冲液并不与细胞或组织中的生理PH相符，但是在生理PH（8.00）的缓冲体系下蛋白会连续洗脱并分成不同的部分。分离系统包括电泳槽和分部收集器，这些装置要置于冰箱中。

2. 凝胶特征

为了得到一个PAGE所需的聚合完全的凝胶，聚丙烯酰胺凝胶需要在室温下凝聚69hr。最后，得到均质的含机械稳定和自由的单体或原子。凝胶的孔径很大，因此分子筛作用在电泳分离中最小化。基于上述原因，凝胶和活性分子之间的相互作用可以忽略。待分离的金属蛋白（如金属分子伴侣，蛋白酶感染性初级因子，金属运输蛋白，淀粉状蛋白，金属酶，金属肽等）不会分解成脱辅蛋白和金属辅助因子。孤立蛋白的生物活性结构（天然或3D构象）在QPNC-PAGE后不会发生构象变化。所以，金属蛋白和蛋白异构体在PAGE中被定量的分成高纯度的部分。QPNC与其它电泳技术如SDS-PAGE，2-DE，等速电泳和CN- PAGE等相比被称为“突破性的方法”。

3. 实验方法

① 储备液

1）200mM Tris-HCl 10mM NaN3 PH10.00，室温

2）200mM Tris-HCl 10mM NaN3 PH8.00，室温

3）40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺2.67C，4℃（新鲜）

② 电泳缓冲液

20mM Tris-HCl 1mMNaN3 PH10.00（除气），4℃

电泳槽上部：500ml电泳缓冲液

电泳槽下部：2000ml电泳缓冲液

③ 洗脱液

20mM Tris-HCl 1mMNaN3 PH8.00（除气），4℃

洗脱室：700ml洗脱缓冲液

④ 分离胶

丙烯酰胺4%T 体积40ml

成分：4ml40%丙烯酰胺/双丙烯酰胺2.67C；4ml 200mM Tris-HCl 10mM NaN3 PH10.00；32 mL H2O；200 μL 10% APS；20 μL TEMED

APS和TEMED最后加入。轻轻搅拌烧瓶中的混合物，注意不能产生气泡。然后把溶液移入内径为28mm，长为40mm有刻度的玻璃柱中。加入3ml正丙醇。60分钟聚合后用电泳缓冲液冲洗凝胶，然后用4ml电泳缓冲液覆盖凝胶表面。在室温下凝集69小时。

⑤ 样品的准备和收集

保持样品（生物液体）温度为4℃。0.3ml甘油和2.7ml样品在分离前混合5分钟。然后把处理好的样品加入到电泳缓冲液的上层。这些蛋白在此电泳缓冲液中不是带负电（PI<10.0）就是带负电（PI>10.0），因此在电场中不是从正极迁移到负极就是从负极迁移到正极。已分离的蛋白分子用特殊的生理洗脱液连续洗脱，并用分部收集器收集。整个分离系统必须在4℃冰箱中进行。

纯化的，半纯化的和未处理的样品都可以用于QPNC。样品分离纯化中应该避免类似于蛋白质沉淀等过程以防止蛋白变性。化学稳定的金属蛋白可以用非变性的凝胶渗透层析来进行进一步纯化

4. 定量和鉴定

Fe， Cu， Zn， Ni， Mo， Pd， Co， Mn， Pt， Cr， Cd和其它金属辅因子可以通过ICP-MS（Inductively coupled plasma mass spectroscopy，电感耦合等离子体质谱）来定性和定量。因为PAGE条带的高纯度和选择性凝集，相关的结构可以用非变性条件下的NMR来分析。

5. 应用

QPNC的应用对象为分子量6-200kDa的酸性、碱性和中性金属蛋白。在测定血液或其它临床样品中独立的金属蛋白结构和功能关系方面具有重要应用，因为不正确的金属陪伴蛋白的折叠。例如超氧化物歧化酶（SOD）的铜陪伴蛋白出现在这些基质中或许预示着神经病变疾病如肌萎侧索硬化病等。QPNC-PAGE，SEC，ICP-MS和NMR等技术的连用可以得到病人或潜在的病人液体基质中相关金属蛋白的生理状态的结构。这一技术可以提高蛋白错折叠相关疾病的诊断和治疗水平。