动物肝脏DNA的提取

一、目的：

了解分离提取DNA的一般原理，掌握从动物肝脏中提取DNA的方法。

二、原理：

在浓氯化钠（1—2mol·L-1）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很大，核糖核蛋白的溶解度很小。在稀氯化钠（0.14mol·L-1 ）溶液中，脱氧核糖核蛋白的溶解度很小，核糖核蛋白的溶解度很大。因此，可利用不同浓度的氯化钠溶液，将脱氧核糖核蛋白和核糖核蛋白从样品中分别抽提出来。

将抽提得到的核蛋白用SDS（十二烷基磺酸钠）处理，DNA（或RNA）即与蛋白质分开，可用氯仿一异戊醇将蛋白质沉淀除去，而DNA则溶解于溶液中。向溶液中加入适量乙醇，DNA即析出。

为了防止DNA（或RNA）酶解，提取时加EDTA（ethy-lenediamine tetracetic acid，乙二胺四乙酸）。

三、器材及试剂：

1．器材：

①新鲜猪肝（一次用不完一定要冷冻保存）

②匀浆器

③离心机5000r·min-1

④量筒50ml（×1）、10ml（×1）

⑤水浴锅

⑥纱布

⑦真空干燥器

2．试剂：

①5mol·L-1 NaCl溶液：将292.3gNaCl溶于水，稀释至1000ml。

②0.14mol·L-1 NaCl-0.10mol·L-1 EDTA-Na溶液：溶8.18gNaCl及37.2gEDTA-Na于蒸馏水，稀释至1000ml。

四、操作步骤：

1．取猪肝20~30g，用适量0.14mol·L-1NaCl-0.10mol·L-1 EDTA溶液洗去血液，剪碎，加入约30~50ml0.14mol·L-1 NaCl-0.10mol·L-1 EDTA溶液，置匀浆器或研钵中研磨，研磨一定要充分，待研成糊状后，用单层纱布滤去残渣，将滤液离心10分钟（4000r·min-1）弃去上清液，沉淀用0.14mol·L-1NaCl-0.10mol·L-1 EDTA溶液洗二、三次。所得沉淀为脱氧核糖核蛋白粗制品。

2．向上述沉淀物加入0.14mol·L-1 NaCl-0.10mol·L-1EDTA溶液，使总体积为37ml，然后滴加25%SDS溶液3ml，边加边搅拌。加毕，置60℃水浴保温10分钟（不停搅拌）溶液变得粘稠并略透明，取出冷至室温。此步操作系使核酸与蛋白质分离。

3．加入5mol·L-1 NaCl溶液10ml，使NaCl最终浓度达到1mol·L-1 ，搅拌10分钟，加入约一倍体积的氯仿-异戊（丙）醇混合液，振摇10分钟，静置分层，取上、中两层液离心10分钟（4000r·min-1）。去掉沉淀，上层清液徐徐加入1.5—2倍95%乙醇，DNA沉淀即析出，用玻璃棒顺着一个方向慢慢搅动，则DNA丝状物即缠在玻棒上。

4．将DNA粗品置于27ml0.015mol·L-1 NaCl-0.0015mol·L-1柠檬酸三钠溶液中，再加入3ml1.5mol·L-1 NaCl-0.15mol·L-1 柠檬酸三钠溶液，搅匀，加入一倍体积氯仿—异戊（丙）醇混合液，振摇10分钟，离心（4000r·min-1 ，10分钟），倾出上层液（沉淀弃去），加入1.5倍体积95%乙醇，DNA即沉淀析出。离心，弃去上清液，沉淀（粗DNA）按本操作步骤重复一次。

5．将上步所得沉淀溶于27ml0.015mol·L-1 NaCl-0.0015mol·L-1 柠檬酸三钠溶液中，然后以线状徐徐加入2倍95%乙醇，边加边搅，取出丝状DNA，依次用70%、80%、95%及无水乙醇各洗一次，真空干燥。保存待用。

五、结果与讨论：

1．所提取的DNA是否是纯品？如何进一步提高其纯度？

2．DNA提取过程中的关键步骤及注意事项有哪些？