关于原核表达载体

yhbdxs:实验思路是这样的，将目的基因连接到含有GFP的表达载体上，得到GFP和目的基因的融合蛋白，再纯化。

我现在还没有选定用哪个载体，请你们帮帮我，太多不清楚的地方了。

E.coli:通常在进行原核表达实验时，选择使用pET系列载体居多。但是pET系列载体不带有GFP基因，其上的His Tag标签是专门用于分离纯化的。通常情况下，目的基因与GFP蛋白融合，用于真核表达的实验较多。

yhbdxs:谢谢E.coli的回答，我爱E.coli！！希望给我带来好运气！

由于时间紧迫，真核表达周期长，只能选择原核表达了。

1、用clontech的pGFP载体可以做原核表达吗？

2、先把目标基因连接到GFP载体上，切下来，连接到pET载体上，可以吗？

3、为什么pET系列载体不带有GFP基因啊？

E.coli:clontech的pGFP载体是原核表达载体，应该符合你的实验要求，但是我没有使用过，因此对其具体操作注意不是很了解。如果你一定要求使用pET载体表达带有GFP报告基因的目的基因，在进行载体构建时，加入GFP报告基因与目的基因融合应该是可行的。不过这样构建起来也是挺麻烦的，不如使用商品化载体方便些。

yhbdxs:在进行载体构建时，加入GFP报告基因与目的基因融合应该是可行的。

如果这样的话，是不是要用到一个辅助载体啊，就是说我一共要用三个载体：

目的基因先克隆到T载体送去测序，然后亚克隆到含有GFP的载体融合，最后再把融合基因连接到pET载体上，进行表达，是这样的思路吗？

我很急，一直在这里等着看结果呢，谢谢E.coli

E.coli:我认为在进行载体构建时，需要根据你的实验要求选择实验步骤：

1.如果在进行目的基因与GFP基因融合时，中间有酶切位点可以满足你的实验要求，可以：

1).将目的基因扩增后克隆至中间载体上测序。（目的基因去除终止密码子）

2).将1).测序好的片段通过酶切位点克隆至pET载体上。

3).如果你现有的GFP基因两侧的酶切位点满足已克隆目的基因的pET载体MCS的要求，可以直接将GFP基因克隆至2).构建好的载体上。

但是这样在目的基因与GFP基因间会存在有酶切位点，至少一个。并且在进行GFP基因克隆时，需要严格考查读码框的准确性，不可以移码。

2.如果在进行目的基因与GFP基因融合时，中间必须紧密相连，不允许有其它碱基，可以：

1).将目的基因扩增后克隆至中间载体上测序。（目的基因去除终止密码子）

2).克隆GFP基因，T载体即可。

3).使用1)./2).质粒为模板，设计引物搭链扩增目的基因与GFP基因，两侧加入与pET MCS相匹配的酶切位点。并克隆至T载体，测序。

4).将3).测序好的片段通过酶切位点克隆至pET载体上。

3.如果在进行目的基因与GFP基因融合表达后，你需要进一步将GFP融合蛋白切除，那么依据2.所示步骤，在进行第3).步搭链扩增时，还需要在搭链引物上设计蛋白酶识别位点，其余相同。以便在进行蛋白表达后，可以使用蛋白酶将GFP融合蛋白切除。

具体的蛋白酶识别位点设计情况，你可以参照pET Vector manual.

乱七八糟的，希望可以对你的实验有所帮助。

yhbdxs:今天下午和老板商量了一下，最终决定用clontech的pGFP载体，虽然还没有把握，现在我只能祈求自己好运气了！

wangjiali:你好：为什么不直接连在载体上酶切测序，还要连接在中间载体上测序？

E.coli:目的基因在进行扩增时，有可能会产生突变。将目的基因克隆至中间载体后，如果测序发现有突变，进行突变修复时比较容易操作。而且PCR产物进行TA克隆的难度远比酶切后克隆至表达载体的难度要小，阳性克隆率高，也比较有利于实验。