硝酸纤维素膜(NC膜)的简介和生产原理

概念

硝酸纤维素膜(nitrocellulose filter membrane，简称NC膜)，在胶体金试纸中用做C/T线的承载体，同时也是免疫反应的发生处。NC膜是生物学试验中最重要的耗材之一。

NC膜的生产原理

匀浆配比

购买回来的原料硝酸纤维素粒子是一种非常普遍的有机化学物，溶解形成混浆，在该浆体内，通过加入一定比例的试剂来调整最后形成的膜的性质，一般主要包含表面活性剂/高分子聚合物/盐离子/成型剂等溶解的一个缓冲体系内。不同的厂家加入的溶液配方不一样，导致了产品的差异。

滚筒铺膜

配好的匀浆通过滚筒，形成了一张薄膜，平摊在十分光滑的平面载体上。过程与造纸非常相似。

成型

当匀浆内的成型剂开始挥发，膜逐步干燥成型。同时在这个过程中由于温度比较高，有些厂家在这个过程采取了在密闭腔体内成型，同时补充配方溶液的形式，来避免一些有效成分的蒸发。

切割

通过以上步骤生产出来的膜是呈一个宽度极大的产品，宽度的大小直接和滚筒的大小相关，滚筒越大生产越方便，但设备的成本也越高.宽膜要经过切割才能成为我们购买到的25mm或18mm（或20mm）宽的膜，而长度上，成品卷膜和宽膜的长度是相同的.理论上可以让厂家切成你需要的任意宽度，但这样会造成原料的浪费和人力成本的增加，后来厂商在和试纸生产厂家的协调过程中，综合用料成本和生产便利性基本确定了上面说的宽度，以次为标准。

从生产过程，我们可以得知，NC膜本身已经添加了表面活性剂来改善亲水能力，而且已经存在有一定的缓冲系统（虽然对纸条测试影响不会很大）。

NC膜的供应商及现状

现在有销售的NC膜品牌型号如下：
PALL(美国)
MILLIPORE（美国），M135（有背衬/无背衬两种） M180（有背衬/无背衬两种）
WHATMAN and SS，Puraband impuraband
SARTORIUS（德国），CN140
伊能（国产），8um 6um
MDI（印度），8um 6um

SS是膜行业的鼻祖，这点所有的膜公司都承认。millipore，SARTORIUS和whatman都是后辈，由于SS在市场竞争的过程中经营方式落后，最后被whatman收购。就产品质量来说SS的AE99和AE98是非常优良的。而MDI是近年才出现的一个膜公司，可能与印度胶体金试纸生产行业的快速发展密切相关，其所有的产品都是在印度生产，经营者为父子两人，父亲负责技术，儿子进行经营。

国产膜伊能主要特点成本较低，性能与一些进口膜很接近，经过一些有针对性的优化后可以用在HCG产品的生产。但不是所有的工厂都能购轻易的完成这个优化工作。膜的国产化是一个趋势，但进口厂家要实现国产化还面临很大的问题，其中厂房设备的搬迁就是一个非常大的问题。

几家供应商的国内联络人和技术支持分别是
PALL（美国），Mr Xiaoliang Tang, Dong Wang
MILLIPORE（美国），Mrs Yang，harry
WHATMAN and SS，Clark，kevin
SARTORIUS（德国），Mr Xu，Iric
伊能（国产），connie，Mr Yang
MDI（印度），Ashawant Gupta

销售模式都是直销式，少量购买需通过代理商购买。价格上PALL、MILLIPORE与WHATMAN相当，SARTORIUS便宜一些，国产膜更便宜一些。印度膜和SARTORIUS价格相同。在科研市场，PALL、MILLIPORE使用最多。生产客户中，MILLIPORE，HATMAN，SARTORIUS占有量相当，伊能现在也开始有一些工厂客户了，MDI量最小投诉也最多。

NC膜的选择

膜的选择涉及到一个膜的分类标准问题，一个供应商可能提供这个膜是8um，但另一个供应商告诉你膜是135s的。这之间的区别与联系是什么？
um指的是膜孔径，而从上面膜的生产过程，我们可以看出，膜的孔径实际上是没有办法界定的。由于干燥成型等过程的非绝对均一，膜的孔径也是非均一的.膜孔径的说法实际上是沿用了一直以来的一个形象称呼.而以秒为单位的定义为，每4cm膜，水的层析时间是**s.该单位已经越来越被各大厂商所接受，成为了一个通用的比较标准.以下我们将采用s单位来进行交流。
换算情况大致为：8um=135s；6um=180s

不同秒数的膜对反应有什么影响呢？首先，我们分析一下液体在膜上的运动过程。一张长度为4cm的膜， 每隔1cm做一个标记， 当液体运动过标记处时记录时间点. 那么你将会发现液体在膜上的运动是呈减速前行的。而两张不同秒数的膜（例如135s， 180s）在同一时间标记点处的运动速度不同.这个试验用清水做不好观察，可以考虑用色素水溶液，非常明显。

那么从这个试验可以看出，在通过同一T线喷点位置时，金溶液通过的速度是快速膜>慢速膜。那么通过速度越快和包被在T线的物质反应时间也就越短，读数快，那么灵敏度也就越低。反之，反应时间长，读数慢，也就灵敏度高。同时还有一个问题是，反应时间越长，发生非特异性结合的可能性就越大，所以过长时间的反应不一定就能够真正的提升灵敏度。所以这里就有一个读数时间/反应灵敏度/非特异性结合的均衡。

其实我们并没有那么多选择。经过使用实践，各供应商一般都只提供两个型号，就是135s和180s。 虽然看到有些厂家的产品目录上型号种类繁多，但这两个型号的定货量就占了95%以上，其他型号供货上也就远不如这两个型号来得顺利。135s一般用在双抗体夹心法，180s一般用在竞争法. 你所要做的是，先选择其中的一个型号， 然后比较不同供应商同一个型号的差异，由于前面说的添加配方与你的试验条件配合的不同，这个差异可能大也可能小。具体要根据试验结果来确定最后的选择。我个人不建议地毯式的测试不同规格/不同厂家的膜，这样成本高，成功的几率也小。

膜的质控方式

本节适合用膜量较大的公司用户参考。对于一卷膜可以用上几个月的用户来说，厂家的质控标准已经完全能满足你的要求，而不需要自己再做相关的质控。

膜的质控虽属于原辅料QC职能，但由于其专业性强，一般都由小样调试人员来执行。膜入原料库后需要进行如下检验工作：

1. 查收COA

在购买时， 供应商会随产品为每个lot的膜提供一张纸质的出厂质量证书， 该证书被称为COA。如果你已经购买某一批次的膜， 而没有索取相应的证书， 如果有需要可提供批号向厂家要求补发。其实在很多行业都有厂商为自己的产品附上COA的习惯。
COA一般只提供给大客户， 对小客户是没有意义的。其内容主要是厂家在产品出厂时做过一些测试的罗列。作用可以理解为质量凭证和测试数据参考。

2. 检查物理性能

膜的物理性能主要是2个参数， 膜厚度和宽度。长度不需要检测。使用中可以关注长度上是否有断面重接现象， 断面多费料则多， 少数发生。厚度，由螺旋测微尺，选择几个测量点检测后算平均。膜生产的必测参数。主要表现为厚度不均匀影响生物原料在膜上的扩散性能，点出来的C/T线宽窄不一，另外也影响爬速。宽度，普通直尺测量。物理性能一般都不会有什么大问题。毕竟检测标准客观，易把握。没有条件执行的厂家可省略。

3. 跑水性能

样本采用含有有色食用色素的水溶液，目的是容易观测，需制作一个简易支架。

操作：注入足够溶液到下部槽内，将不同批次膜每隔1cm做一次标记（总长大于4cm）并放到倾斜支架，整个支架下端放入溶液槽，膜开始吸液，计时。记录每个标记处的通过时刻，并与对照组比较。跑板时，理论上溶液呈水平线形式上吸，观测是否有波浪倾斜或包围润湿等反常现象。

4. 点样测试

C/T线出线时间，其他试验条件相同情况下，记录和比较C/T线出现时间是否与对照有差异。

灵敏度，比较不同样本浓度情况下，T线的变化是否和对照组同。一般每批次膜取前端一段用来测试即可。由于制造过程的不均一性， 不同批号的灵敏度会有一定差异，当大批量使用时，这种差异影响是非常大的，那么就要按照灵敏度表现将不同批号的膜进行分类。在膜的STOCK中要能够轻易的分辨出来。当进入后期生产调用时，就能根据这些分类，按照订单要求取用不同批号的膜，或者用强灵敏度的原料和差灵敏度的膜来搭配。

关于膜的批内差。批内差是肯定存在的，只是差距大小的问题，依据一般的测试条件是很困难获得详细的数值，因为你不可能对每一卷膜的每一段都做详细的测试。减小膜批内差的最有效方法是不购入边缘膜带。前面说过膜的生产方式，生产出的半成品是宽幅很大的一个膜面，要通过截面裁切才能获得25mm或者20mm的宽度。那么就有中间部分，和边缘部分之分.越靠近中间部分，膜的均匀性越好，边缘部分则相对要差，就造成了批内差。一般可以通过COA获得具体位置信息，例如MILLIPORE就在切割后用字母A，B，C……来表示切出的窄膜在宽幅膜中的位置。

如果是试用某个型号的膜小样，还需要在以上检测后加入膜加速老化试验，包括膜单独的老化试验和点好膜后产品的老化试验， 具体试验方法请参看我以前写的研发思路一文。

膜的深入探讨和应用技巧

从本节开始，我们开始对膜进行深入讨论和谈一些应用技巧。

1. 蛋白与膜的结合原理

蛋白与膜的结合原理， 已知的结合力包括疏水作用力\H键\静电作用力等，确切的结合原理并不明确，主要靠假说来支撑。主要有两种假说：

  1）首先两者靠静电作用力结合，然后靠H键和疏水作用来维持长时间结合。

  2）首先两者靠疏水作用结合，然后靠静电作用来维持长时间结合。

两条假说，都表明其结合过程分为两步，首先结合和后面长时间结合。由于结合原理的不明确性，导致在这方面的工作非常依赖实践经验。

2. 膜对结合的影响

  1）膜孔径

有些技术人员倾向使用膜孔径来区分不同的膜，但是请注意这只仅仅限于同一厂家的产品，如果是不同厂家的产品，这种比较是无意义的。膜孔径与层析速度的关系，已在上文描述。随着膜孔径减小，膜的实际可用表面积递增，膜结合蛋白的量也递增。 估量表面积的参数为表面积比率（实际可用表面积与所用膜平面积的比率）。

另外，膜孔径越小，层析速度也越小，那么金标复合物通过T线的时间也就越长，反应也就越充分。

综合以上两点，结论为膜孔径越小灵敏度越高。但是同时也减慢了跑板速度，增加了非特异性结合的机会，也就是假阳性越高.所以要按照试验结果挑选适合实际项目的膜，找到合适的平衡点。

  2）不同厂家的膜差异

这个差异主要来源于两点：

①生产膜时，使用的聚合物和表面活性剂的来源，类型，数量不同。同理，在膜处理中这两类物质一般会对性能产生较大影响。 ②处理过程不同。

3. 生物原料，缓冲溶液的试剂和配方

  1）生物原料， 作为CT线的生物原料使用情况各异，所以这里只做略述。

首先，单克隆抗体与膜的结合优于多克隆抗体，主要时由于多克隆抗体有很多不同的表面位点，而各位点与膜的最佳结合条件都有细微的差别，毫无疑问就增加了优化难度。其次，分子量越大，蛋白越难结合到固相材料上。

  2）缓冲液

大家最关心的可能就是希望获得一个性能优良的配方，包括缓冲液，封闭液等等处理溶液配方。
其实我也无法提供给你一个万用配方清单。因为不同的反应体系需要不同的配方来支持， 而不同机构的反应体系又有差异。想获”鱼”先学”渔”.。为了不误导大家，我在下面涉及到配方的问题上，仅提供思路，具体配方请自己摸索。
缓冲液的构成一般是：PBS（或其他缓冲体系）+作用物质（针对某一特定问题）+PH调整. 我在参考过以前的各种资料后，个人意见为配方原则为宜简不宜繁，根据自己的需要添加作用物质，原来的很多需要添加的作用物质，由于膜制造技术的改进已经不再需要。
　　推荐的缓冲体系为0.01M PBS PH7-7.2， 该缓冲体系对多种抗原抗体都有良好的适应性。
　　作用物质的情况大致罗列如下：
　　少量NACL，减少信号强度，消假阳。
　　有机醇（甲醇，异丙醇等），润湿膜，减少膜带有的静电，利于结合包被。个人不推荐，因制膜工艺改进。
　　表面活性剂（TW20，TX100），增加亲水力，可避免线条中空现象，也可增色。
　　糖，保护剂，减缓老化速度，也可以增加亲水力同上。
　　调PH到某个位置，可以消假阳。

4. 点样环境

环境湿度对点膜过程非常重要。最佳湿度一般在45-65%。湿度过低，膜上容易聚集静电荷，点膜容易出现散点，导致测试会出现疏水斑。湿度过高，膜上毛细作用加强，点膜容易引起CT线变宽甚至扩散。为了保证点样时膜湿度的均一性，一般在点样前把膜放到该湿度条件下平衡一段时间。

5. 点样仪器与膜面情况的关系

目前有两种点样方式，划膜式和非接触点膜式.非接触点膜式优于划膜式，进口划膜式优于国产划膜式。

因划膜式为软管将抗体划到膜表面，而膜本身的物理性质为软脆，划管会在其表面留下印痕.进口的划膜机由于使用的材料和控制系统较好，所以留下的划痕较轻，而国产仪器较差，留下的划痕也就比较严重。 划痕容易对层析的金标复合物形成阻力，导致假阳性。 同时容易出现跑板时在T线位置出现若有若无一条细线（鬼线），而跑板结束后鬼线消失的奇怪现象。

6. 膜的宽度与点样位置

膜的宽度一般有18mm（or 20mm）和25mm两种， 分别使用在做测试条和做测试板上。然而，不同的T线点样位置将带来不同的灵敏度。点样位置上移，金标复合物通过T线位置时速度变慢，反应时间增加，灵敏度升高。反之灵敏度降低。这个方法可以用来改变灵敏度和消除假阳性。

7. 溶液在膜上的扩散

溶液在膜上的点样量一般情况下为1ml/cm。溶液在膜上的扩散是趋向两端的，喷点上去的是均匀的抗体溶液，但当干燥时线条边缘的干燥速度高于中间，中间的抗体会不断向两边扩散，所以干燥后抗体是向线条的两端聚集的。一般情况下不影响你的试验。如果你发现线条出现两端红，中间淡的现象，就要考虑这个问题了。可以加如上面说的作用物质来解决。

8. 点膜前后的封闭作用

从供应商处购买回的膜基本上都是已经优化处理好的，直接点膜就可使用.然而我们还是经常会遇到关于封闭的讨论。其实封闭不象大家认为的那样，一封闭什么问题都解决了. 老问题走了新问题又来了，而且更麻烦，我要说的是慎用封闭。我极其反对点膜前封闭的做法。原因为厂家在生产膜时候，各种配方是混合加入原浆的。而点膜前封闭时要将膜浸泡在封闭液内，必然扰乱了膜内正常的物质分布。由此引发了许多问题，也降低了工作效率。也有厂家遇到不封闭就无法包被上膜的问题，其实可以通过其他办法来解决，封闭必然是下测。
我经常使用的封闭手法有两种：流动封闭，将作用物质处理在样品垫上。膜上定点封闭，将作用物质配成溶液喷点在膜的特定位置上。该方法需要使用BIODOT的AIRJET喷头，可以将不合格的半成品大板重新复活。只要是将封闭做在了膜上，就必然会对产品的稳定性造成影响，具体的影响程度要通过稳定性测试来评判。

9. 膜的储存

刚生产出的膜一般含有5-10%的水分。关于膜的老化机理，有个理论支持，不过争议比较大。理论认为：膜的老化是因为膜上的水分蒸发，使膜变得疏水，带电荷并变脆。储存膜一般要求是避光，密封，过干或过湿都不利。在这种保存条件下，一般可以放置两年。但是如果膜上做了封闭处理，就要根据具体试验情况来判断了。有些膜由于生产工艺的问题，使用后灵敏度会在一段时间内发生变化，遇到这种问题，就需要在点膜后放置一段时间，待稳定后方可进入调试生产。
　　硝酸纤维素膜NC膜
　　规格: 15X20cm
　　孔径: 0.45μm
　　保存: 5-15℃密封保存,保质期一年
　　产品简介: 本品外观洁白，膜正面呈光泽，与水接触应立即浸润，不能立即浸润老者视为失活，不能点样，膜面有花斑或有粉性结构皆视为次品。用于转移电泳，宜选孔经0.22或0.45，以保证膜的强度，并减少穿透损失，硝纤膜过份干燥时脆,湿时有弹性，操作时室内应保持中常温度，避免过份干燥，防止发脆，本品静电吸附膜的亲水性好，渗滤时间适中，蛋白吸附力强，转膜的蛋白集中而不扩散，显色的灵敏度和特异性高，背景低。

NC膜的应用举例

分子杂交

杂交技术有固相杂交和液相杂交之分。固相杂交技术目前较为常用，先将待测核酸结合到一定的固相支持物上，再与液相中的标记探针进行杂交。固相支持物常用硝酸纤维素膜。

固相杂交包括膜上印迹杂交和原位杂交。前者包括三个基本过程：第一，通过印迹技术将核酸片段转移到固相支持物上；第二，用标记探针与支持物上的核酸片段进行杂交；第三，杂交信号的检测。

用探针对细胞或组织切片中的核酸杂交并进行检测的方法称之为核酸原位杂交。某特点是靶分子固定在细胞中，细胞固定在载玻片上，以固定的细胞代替纯化的核酸，然后将载玻片浸入溶有探针的溶液里，探针进入组织细胞与靶分子杂交，而靶分子仍固定在细胞内。例如。可用特异性的细菌、病毒的核酸做为探针对组织、细胞进行原位杂交，以确定有无该病原体的感染等。原位杂交不需从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，在临床应用上有独特的意义。下面以放射性标记探针与固定在NC膜上的核酸进行杂交为例，杂交反应操作如下：

⑴配制所需试剂
　　SSC溶液(20×)：3mol/L NaCl，0.3mol/L柠檬酸钠。
　　Denhardt’s溶液(50×)：聚蔗糖5g，聚乙烯吡咯烷酮5g，牛血清白蛋白(BSA)5g加水至500ml。
　　预杂交液：6×SSC，5×Denhardt’s溶液，0.5％SDS，100?g/ml经变性或断裂成片段的鲑精DNA。

⑵将含靶核酸的NC膜漂浮于6×SSC液面，使其由下至上完全湿润，并继续浸泡2分钟。

⑶将湿润NC膜装入塑料袋中，按0.2ml/cm2的量加入预杂交液，尽可能挤出气泡，将袋封口，置68℃水浴1-2小时或过夜。

⑷将双链探针做变性处理使成单链，即于100℃加热5分钟，然后立即置冰浴使骤冷。

⑸从水浴中取出杂交袋，剪去一角，将单链探针加入，尽可能将袋内空气挤出去，重新封口，并将杂交袋装入另一个干净的袋内，封闭，以防放射性污染。

⑹将杂交袋浸入68℃水浴，温育8-16小时。

⑺取出杂交袋，剪开，取出滤膜迅速浸泡于大量2×SSC和0.5％SDS中，室温振荡5分钟，勿使滤膜干燥。

⑻将NC膜移入盛有大量2×SSC和0.1％SDS溶液的容器中，室温漂洗15分钟。

⑼将NC膜移入一盛有大量0.1×SSC和0.5％SDS溶液的容器中，37℃漂洗30分钟至1小时。

⑽将NC膜移入一盛有新配0.1×SSC和0.5％SDS溶液的容器中，68℃漂洗30分钟至1小时。

⑾取出滤膜，用0.1×SSC室温稍稍漂洗，然后置滤纸上吸去大部分液体，待做杂交信号的检测。