RNase Protection Assay--RNA酶保护试验

RNA酶保护试验(RNase Protection Assay,RPA)是通过液相杂交的方式,用反义RNA探针与样品杂交，以检测RNA表达的技术。与Northern杂交和RT-PCR比较，RPA有以下几个优点：

1． 检测灵敏度比Northern杂交高。由于Northern杂交步骤中转膜和洗膜都将造成样品和探针的损失，使灵敏度下降，而RPA将所有杂交体系进行电泳，故损失小，提高了灵敏度。

2． 由于PCR扩增过程中效率不均一和反应“平台”问题，基于PCR产物量进行分析所得数据的可靠性将下降，而RPA没有扩增过程，因此，分析的数据真实性较高。

3． 由于与反义RNA探针杂交的样品RNA仅为该RNA分子的部分片段，因此，部分降解的RNA样品仍可进行分析。

4． 步骤较少，耗时短。与Northern杂交相比，省去了转膜和洗膜的过程。

5． RNA-RNA杂交体稳定性高，无探针自身复性问题，无须封闭。

6． 一个杂交体系中可同时进行多个探针杂交，无竞争性问题。

7． 检测分子长度可以任意设置，灵活性大。

RPA的缺点是需要同位素标记探针。

一、试剂准备

1． GACU POOL：取100mM ATP、CTP、GTP各2.78μl、100mM UTP 0.06μl，加DEPC H2O至100μl。

2. 杂交缓冲液:PIPES 0.134g、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、5M NaCl 0.8ml、甲酰胺8ml，加DEPC H2O至10ml。

3. RNase消化液：5M NaCl 120μl、1M Tris-HCl(pH7.4) 20μl、0.5M EDTA（pH8.0）20μl、RNase A(10mg/ml) 8μl、RNase T1(250U/μl) 1μl，加DEPC H2O至2ml

二、操作步骤

1．反义RNA可由含T7或SP6启动子的重组质粒为模板制备，也可以用含启动子的PCR产物为模板制备，本文介绍后者。

（1）设计含T7启动子的PCR引物

由于PCR产物将作为合成反义RNA的模板，所以一对引物中的下游引物5’-端要含T7启动子序列: T7启动子序列为：5’-TAATACGACTCACTATAGGG

引物设计的其他要求与一般PCR引物的设计相同。PCR产物的长度决定了反义RNA探针的长度，具体设计时可考虑100-400bp长。最好采用巢式PCR，即先扩增出一较长的片段，再以该片段为模板扩增出较短的片段，以保证探针的特异性，如下图所示

（2）PCR 先用上游引物和下游引物Ⅰ进行PCR，再以PCR 产物为模板,用上游引物和下游引物Ⅱ-T7进行二次PCR(具体操作参见PCR章节)。

（3）探针合成标记与纯化

在0.5ml 离心管中加入下列试剂：

RNasin （40U/μl） 0.5μl

GACU POOL GAC

（含GTP、CTP、ATP各2.75 mM,UTP 61μM） 2μl

[α-32P]UTP(10μCi/μl) 2.5μl

DTT (二硫苏糖醇，0.1M) 1μl

5×转录 buffer 2μl

模板（50ng/μl） 1μl

T7 RNA 聚合酶 (15U) 1μl

混合后，短暂离心，37℃保温1hr。

加入DNaseⅠ（10U/μl）1μl, 37℃ 15min, 然后75 ℃ 10min以灭活DNAseⅠ和T7 RNA 聚合酶。

加入：饱和酚 50μl

氯仿 50μl

酵母tRNA（2μg/μl） 4μl

DEPC H2O 100μl

室温下充分混匀，离心10000g×2min。取上层液置另一0.5 ml离心管中，加入100μl氯仿，混匀，离心10000g×2min。将上层液转移至另一0.5ml 离心管中，再加入3M NaAc 10μl、预冷无水乙醇250μl，混匀后，-20℃静置30min。4℃离心13500g×10min。弃上清液，沉淀用75%乙醇100μl洗涤，4℃离心13500g×2min, 弃上清液。室温下挥发残留乙醇。加入50μl杂交缓冲液溶解沉淀，4℃下保存待用。可用尿素-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测探针质量。

2．杂交

（1） RNA提取后溶解在杂交缓冲液中，浓度为1μg/μl。

（2）取8μl RNA加入1-3μl探针（根据探针检测结果调整）于0.5ml 离心管中。

（2）80℃保温2min，然后40-45℃下杂交12-18hr。

3. 消化

(1) 杂交管于37 ℃保温15min，加入RNase消化液，37 ℃保温30min。

(2) 加入10%SDS 10μl、10μg/μl蛋白酶K 20μl，混匀，37 ℃保温10min。

(3) 加入65μl饱和酚和65μl氯仿，混匀，室温离心，10000g×2min。

(4) 转移上层液到另一0.5离心管中，加入10μl酵母tRNA和3M NaAc 15μl，再加入200μl异丙醇，混匀后，置-20℃ 30min，4 ℃离心,135000g×10min。

(5)   弃上清液，室温下挥发乙醇，加入5-8μl上样缓冲液溶解沉淀。

4、电泳与放射自显影

（1）配制凝胶：(50ml)

40%丙烯酰胺-亚甲双丙烯酰胺（19：1）       6.25ml

5×TBE                                 10ml

尿素                                    24g

加H₂O至50ml

溶解后加入25%过硫酸胺50μl，TEMED 50μl，混匀，注入电泳槽中，插入梳，待胶凝固。

（2）预电泳

以1×TBE为上下槽电泳缓冲液，加上电压后进行预电泳，如果用测序电泳装置，电压应达2000v以上，功率设定为100w，温度设为50 ℃。待胶板温度达50 ℃时，暂停电泳，准备加样。

（3）加样

将已溶解在加样缓冲液中的样品80 ℃加热2min，立即加样到胶孔中，电泳1-2hr。（电泳条件同预电泳）。

（3）电泳结束后，打开胶板，用滤纸取下胶，覆上一层保鲜膜，放置于暗盒中，暗室红光下，压上一张X片，盖上暗盒，-70℃曝光1-3天。暴光结束后，将X光片显影、定影、水洗、晾干。

三、注意事项

1．本实验大部分为RNA操作，注意RNA酶的污染。

2．RNase消化液消化未杂交的单链RNA和探针RNA，当探针与样品之间有碱基错配时，错配位点也将被消化，因此会产生片段较小的杂交片段。因此进行PCR时，采取尽量减少错配的措施。

3．同位素对RNA合成有一定影响，有时会产生非全长的探针。因此，标记时间不宜过长。

4．RNase消化液有时会产生过度消化而无检测信号，可以将消化液稀释10-100倍后使用。