培养细胞的保存和复苏

做实验前要先学会冻存，以备自己在后面的实验中能保持同一来源、稳定可靠的细胞，且可减少污染或其它不利影响。

1、影响冻存细胞活性的因素

（1）细胞冻存保护剂：常用的有二甲基亚砜（DMSO）和甘油，常用的浓度为5%-10%（90%小牛血清）。DMSO对二倍体细胞的毒性较甘油小。

（2）细胞悬液的冻结速度：慢冻时冰冻在细胞外形成，因此不致损害细胞。多数细胞以每分钟下降1℃的速度，降至-20℃冻结。均可获得满意效果。

（3）保存温度：液氮罐，可达到-196℃，此时所有的物理化学活动均降至最低限度，以保证细胞长期保存。

（4）复苏：急速融化复苏可防止损害细胞。冻结细胞从液氮中取出后，应立即放入37℃~43℃的水浴中，30秒至一分钟内融化。

2、冻存与复苏方法

适用于原始组织、原代细胞和细胞系（株）。

（1）细胞用胰蛋白酶+EDTA消化后用冻存液稀至2~5X106/ml。

（2）分装于2ml冻存管中，装量1ml，封口，作好标记，用几层纱布扎好。

（3） 冻存管进入液氮前应有一个渐降温的过程，以1℃/min的速度降温，一般挂在液氮上空8小时后，投入液氮贮存罐中长期保存。

（4）为使冻存的细胞复苏，将冻存管置于37℃~43℃水浴中，充分摇动使其急速融化，30秒至1分钟内完成。

（5）细胞悬液低速离心，去除上清中的保护添加剂，加入原来使用的生长液，置37℃培养。

基本设备和试剂

设备（略），环境要求清洁、空气干燥和无烟尘。

基本试剂

培养液：①1640溶于新蒸的三次蒸馏水中，搅拌使其充分溶解，过滤除菌即可。②小牛血清用前56℃X30分钟灭活（破坏补体）分装置-20℃保存备用。③青链双抗液将100万单位的青霉素钠盐和硫酸链霉素用高压2次后的三蒸水100ml充分溶解，分装冻存于-20℃，使用前融化，每100ml生长液中加1ml，即使用终浓度为含P.S 100μg/ml。（注：P.S不能冻融多次，应少量分装，一次用完）。④NaHCO3液，用于调整pH值，常用浓度为5~6%，配制用三蒸水溶解后过滤除菌或高压灭菌，分装4℃保存。⑤胰蛋白酶在pH 8.0，温度37℃时作用力最强（详见配方）。⑥EDTA液（详见配方）。

附：

胰酶消化液配方（500ml）

NaCl 4g

KCl（19%）1 ml

Na2HPO4 0.126g（12H2O）

Tris1.5g（三羟甲基氨基甲烷）

以上药物充分溶解后加水至500 ml，然后再加胰蛋白酶5g，最后用1N HCL调pH至7.7，过滤除菌分装，然后-20℃保存备用。

EDTA液配方（0.2% 1000ml）

EDTA（versene） 2 g

NaCl 8g

KCl 0.2g

Na2HPO4（12H2O） 2.9g

KH2PO 40.2g

以上药物同样充分溶解后，加新鲜的三蒸水至1000 ml，分装然后高压15磅30分钟灭菌，最后4℃保存备用。

细胞冻存液：小牛血清90℅与二甲基亚砜（DMSO）10℅混合；-20℃冰箱保存备用。或小牛血清30℅，1640培养液60℅，DMSO10℅混合； - 20℃冰箱保存备用。