血清脂类测定方法

脂蛋白和脂质测定方法学评价血浆脂蛋白和脂质测定是临床生化检验的常规测定项目，其临床意义主要是：早期发现与诊断高脂蛋白血症；协助诊断动脉粥样硬化症；评价动脉粥样硬化疾患如冠心病和脑梗塞等危险度；监测评价饮食与药物治疗效果。

一、血浆脂蛋白测定

1、超速离心分离纯化法超速离心法是根据血浆中各种脂蛋白的比重（密度）的差异，在强大离心力作用下进行分离纯化的一种方法。血浆在不同密度盐溶液中经过超速离心，各种脂蛋白可按密度大小漂浮于不同盐溶液介质中。脂蛋白漂浮的衡量单位是漂浮率(Sf)。

Gofman等于1950年确定，血浆脂蛋白在比重为1.063的NaCl溶液中（26℃），每秒每达因（ldyn=10-5N）克离心力的作用下的漂浮速度，称为1个Svedbery单位（10-13s）。Sf越大，脂蛋白密度越低。一般操作方法是将血浆置于已准备好的不同密度梯度的盐溶媒介质中，在强大离心作用下，各脂蛋白依其自身的Sf不同，分散于离心管中的密度梯度溶媒层，达到分离纯化的目的。超速离心法是分离纯化脂蛋白的有效技术，目前广泛应用于脂蛋白、载脂蛋白代谢的研究中。

2、电泳分离法不同脂蛋白因蛋白质含量不同、其电荷量不同，故可用电泳方法进行分离，并根据血浆脂蛋白电泳迁移率不同予以判断确认。电泳支持物一般常用醋酸纤维薄膜、琼脂糖凝胶或聚丙酰胺凝胶。

由于醋酸纤维薄膜要预处理，很繁杂，外加电泳时间过长，目前已很少使用。临床检验中主要采用琼脂糖凝胶电泳进行分离，快而较为准确，仪器设备要求不高，被广泛采用。聚丙烯酰胺凝胶作为支持物分离脂蛋白，值得推荐给临床使用。

电泳分离法不论用何种支持物，血浆脂蛋白需用亲脂染料如苏丹黑B等进行预染再电泳，电泳完毕，脂蛋白根据电荷量不同，移动在不同的位置，再置于光密度计内进行扫描，计算出各种脂蛋白的百分比，该数值乘以血浆总脂量，即可求出α-脂蛋白、β-脂蛋白和前β-脂蛋白含量，乳糜微粒停留在原点，无法测出其含量，正常空腹12h后，血浆中无CM存在。也可将电泳毕的琼脂糖凝胶脂蛋白区带切割置于试管中，加水溶解，进行比色，测出各自百分比，这一手工半定量法无法测准，属淘汰之列。

⒊沉淀分离法由于脂蛋白的组成及理化性质不同，在不同的聚阴离子和2价不同金属离子（Mn2+、Mg2+、Ca2+、Ni2+、Co2+）以及不同pH值条件下，使脂蛋白与聚阴离子结合形成复合物沉淀，以达到分离定量各种脂蛋白的目的。如肝素锰沉淀血清中VLDL和LDL，离心沉淀，HDL则留在上清液，再定量HDL量，即为血浆HDL的量。也可采用聚乙烯硫酸盐沉淀LDL，离心去上清液留沉淀，再定量沉淀其中的LDL，即血浆的LDL量。脂蛋白是一种既有蛋白质又有胆固醇，还有磷脂的复合体，如何定量，尚无一种较为理想的方法。

目前仅以测定脂蛋白中胆固醇总量的方法作为脂蛋白的定量依据，即测定HDL、LDL或VLDL中的胆固醇，并分别称为高密度脂蛋白-胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）或极低密度脂蛋白-胆固醇（VLDL-C）。这类测定方法是目前临床广泛使用的方法，快速并较为准确。⒋遮蔽直接测定法利用脂蛋白中某种特异抗体等物质，先将血浆中LDL和VLDL包裹保护，不受测定胆固醇试剂的影响，而直接测定未被包裹的HDL中的胆固醇，在不离心分离条件下，测定出HDL的胆固醇含量，快速准确，是近年来发展的新技术，值得推广应用。

二、血清总脂质测定

血清总脂质主要包括FC、CE、PL和TG等。血清总胆质测定除作为脂质代谢紊乱及有关疾患的协助诊断外，还可用于血总脂增加的原发性胆汁酸肝硬化、肾病综合征或急慢性肝炎以及血总脂减少的重症肝炎、肝硬化等的严重肝实质性损害、恶液质、甲状腺功能亢进和吸收不良综合征等疾患的协助诊断。血总脂一般随年龄增加而升高，40岁以上者显著增加，65-70岁者反而降低。测定方法不同，正常参考值有一定的差异。测定方法分两大类：一类是抽提法，将血清脂质通过脂质抽提剂提入某一介质中，再进行定量；另一类是直接测定法，即无需抽提。

1、脂质抽提法脂质存在于血清脂蛋白中，利用甲醇或乙醇使其与蛋白结合的脂质分离，再利用甲醇或乙醇的非极性有机溶媒使脂质溶于其中。Bloor溶剂（醚：醇为1：3，V/V）或FovCh溶剂（氯仿：甲醇为2：1，v/V）的醚氯仿等非极性溶剂的混合液，可提高切断脂质与蛋白质的结合的能力，达到抽提的目的。血清脂质抽提入有机溶液后，蒸发干固，除去有机溶液，通过加热氧化，再显色定量。

2、脂质直接测定法如Sulfo-phospho-Vanillin法是加浓硫酸入血清加热，冷却后，加试剂显色（即SPV反应）直接测定出血清总脂质。

三、胆固醇测定

血清中胆固醇包括CE和FC，酯型的CE占70％，游离型FC占30％。FC中的C3的-OH在LACT作用下，可分别与亚油酸（43％）、油酸（24％）、软脂酸（10％）、亚麻油酸（6％）、花生四烯酸（6５）、硬脂酸（3％）等脂肪酸结合而成。血清中胆固醇在LDL中最多，其次是HDL和VLDL，CM最少。血清总胆固醇测定方法分为化学法和酶法两大类。

⒈化学法化学法一般包括：①抽提；②皂化；③毛地黄皂苷沉淀纯化；④显色比色四个阶段。代表性的方法有Sperry-Webb法，包括①到④步骤操作过程，常规操作中多省去了②、③。或者用省去②、③步骤的Zak-Henly法及省去③步骤的Abell-Kendall法，现将此法作为标准参考方法予以利用。

⒉酶法测定CE在胆固醇酯酶（cholesterolesterase,CHE）作用下水解成FC和FFA，FC再经胆固醇氧化酶（cholesteroloxidase，COD）氧化成△4胆甾烯酮和H2O2，再分别定量O2的消耗或者H2O2的生成量，或者△4胆甾烯酮生成量，以作为FC的定量依据。该法是目前常规应用方法，快速准确，标本用量少，便于自动生化分析器作批量测定。