抗原制备
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一个良好的抗原必须具体的条件：
（1）分子足够大。对于多肽或蛋白质类的抗原来说，一个抗原决定簇（又叫表位，epitope），通常由6-8个氨基酸残基组成。而平均每5-10 kD才有一个表位，因此分子太小的多肽或蛋白是很难有一个表位的。
（2）外源性强。在个体形成的早期就对自身物质形成了免疫耐受，因此如果和机体内的物质完全一样或者是相似就很难引起机体的免疫应答。如果是利用免疫赦免区的成份（如大脑、眼球、睾丸内部成份）则不必考虑外源性。
（3）结构尽量复杂。简单重复的物质是不具有免疫原性的，拿明胶来说，它的分子量非常大，而且外源性也很强，但是组成明胶的氨基酸多为直链氨基酸，在体内容易被降解，因此它的免疫原性很弱。类似地，淀粉、核酸、多聚Lys的免疫原性也很弱。
（4）可降解性好。作为抗原，必须是可以降解的，塑料、不锈钢等难降解的物质免疫原也很弱。由D-型氨基酸组成的物质免疫原性也很弱，同样是因为机体不能降解D-氨基酸组成的蛋白或多肽。
常用的抗原可以通过以下方式制备：
（1） 纯化的天然蛋白质。
由于天然的蛋白存在修饰，而且结构比较复杂（除了线性表位还有结构表位），因此天然的蛋白质是很好的抗原。但是天然的蛋白很难达到较高的纯度，这给免疫和后面的纯化带来了不少麻烦，而且只适合在机体细胞内表达量比较高的蛋白。有一个很典型的例子就是大家使用的二抗，就是从一种动物血清中分离出抗体，然后用它作抗原（有的需要酶解分离出重链和轻链）免疫另一种动物。站长准备写一篇文章专门讨论一下天然蛋白的纯化，敬请期待！
（2）纯化的重组蛋白。
相对于天然蛋白来说，重组蛋白比较容易获得得较高的纯度，而且鉴定也比较方便，整个生产过程更容易掌握。
相信大家都做过重组蛋白，所以关于纯化我就不多说了，值得注意的是重组蛋白为了纯化的方便，通常需要带一段标签（如GST、undefinedHis、Myc、MBP、Flag、Fc等)，在免疫中动物体通常会产生这些标签的抗体，在后面的纯化过程中需要去掉这些标签的抗体，比如说可以使用对应的另一种标签的重组蛋白纯化抗体，或者先用纯标签蛋白吸附掉血清中的标签抗体，然后再用重组蛋白纯化目的抗体。undefinedHis这个标签比较小，而且免疫原性弱，因此由它产生的抗体几乎可以忽略，如果用它作为重组蛋白标签就不需要考虑去掉由标签产生的抗体。
另外，重组蛋白因为不存在修饰，也不存在高级结构，因此最终生产出来的抗体可能无法识别天然蛋白，难以用于某些实验。如果你怕麻烦不想生产蛋白，你可以去看看市场上有没有制备好的蛋白，这样可以节省不少时间和精力。
（3）人工合成多肽。
很多蛋白属于家族蛋白，而这些家族内的蛋白相似度都很高，以Actin（肌动蛋白）家族来说，alpha-actin、beta-actin、gamma-actin之间的相似度都很高，相互之间只相差几个氨基酸，另外，不行物种之间的Actin同源性也极高，此时如果用对应的天然蛋白或者重组蛋白免疫动物往往不能产生出抗体，或者生产的抗体可以同时识别这三种肌动蛋白，此时最好的解决办法就是人工合成它们之间不相同的区域作为抗原进行免疫。
值得注意的是，根据前面说的，如果分子太小是很难引起机体发生免疫反应的，所以合成好多肽后还需要将多肽连在一个大的载体上以增加其免疫原性，常用的载体有：BSA（牛血清白蛋白）,RSA(兔血清白蛋白),HSA（人血清白蛋白），OVA（卵清蛋白），GST（谷胱甘肽S转移酶），KLH（Knoweyhole Limpet Hemocyanin，钥孔戚血蓝蛋白），MAP（多价抗原肽，主要指多聚Lys）。
设计抗原时还需要注意：a.序列上的外源性。设计的多肽序列不能在被免疫的动物体内存在相同的序列，否则你的多肽的部分很难引起免疫反应。关于同源性，可以用Blast去查一下。
b.亲水性。蛋白质总是倾向于将亲水部分暴露在外而将疏水部分隐藏在内部，因此设计的多肽应该尽量亲水以便更好地引发免疫反应。DNassist，GCG，ProtScale等软件都可以对多肽序列的亲水性进行预测，关于软件的使用请大家自己学习。
c.N端与C端的选择。一般来说末端的肽段比中间的肽段好（暴露充分），对于膜蛋白来说，C端疏水性比较强，宜选择N端。
d.氨基酸的各类。序列中不能含有太多的Pro（脯氨酸),一般可以含有1-2个Pro。另外，尽量包含MHCⅡ 类分子偏好的氨基酸Asp，Tyr，Phe，同时避免容易发生糖基化和磷酸化的位点的氨基酸。
e.为了偶联载体，通常需要多加一个氨基酸作为“桥”，目前用得比较多的是Cys，它应该加在对抗体产生不重要的那一端。
f.多肽的长度。为了能够达到一个表位的跨度，设计的多肽不能少于6个氨基酸，通常的要求是8-20个氨基酸，如果设计的多肽太长则可能会形成二级结构，同时合成多肽的成本也比较高。关于多肽与载体的偶联请点击这里查看。
（5）组织、全细胞或细胞组分。当我们不清楚自己需要的抗原，比如说想制备出肿瘤特异性抗原的抗体的时候，往往需要以组织、全细胞或者细胞组分作为抗原进行动物免疫。如果以组织作为抗原，则需要切除新鲜的组织，用生理盐水洗干净，然后用滤网和研杵将其分离成单个细胞。
如果是以全细胞作为免疫原，则需要洗去培养基中的血清，建议直接以完整的细胞作为免疫原而不将其破碎，因为完整的细胞具有更强的颗粒性和外源性。组织来源的细胞和人工培养的细胞作为免疫原时宜用腹腔免疫的途径进行动物免疫，而不建议用皮下免疫。对于细胞组分作为抗原，重点则在细胞组分的分离上面。
细胞膜和细胞质的分离可以采用低渗法（只需要配一个低浓度的缓冲液，另外加入MgCl2可以稳定细胞核使其不破碎），也可以加入Ca2+进行匀浆，然后再离心，细胞膜就在下面形成沉淀。细胞内部细胞器的分离则主要依靠密度梯度离心了。有些细胞器的密度相差比较近，因此可能需要更细的密度梯度离心。
有时候也可以采用一些特别的方法进行辅助，比如说有位仁兄写了一帖叫“从纯化到星辰”的提到，线粒体和过氧化酶体沉降系数很接近,用密度梯度离心的方法不太容易分开，于是可以往老鼠体内注射Triton WR1399,这种去垢剂不能被老鼠代谢掉而积累在肝脏的线粒体内，于是这时候的线粒体密度就变小了，便容易与过氧化物酶体分开了。有关利用细胞进行动物免疫的资料大家可以参考一下张学光和金伯泉以及他们学生的文章。
