哮喘动物模型制作的个人经验

健康 Wistar 大鼠 雌雄不限 30 日龄 体重 60-80 克 ,随机分组 每组 10 只 依据分组不同分笼饲养 可以自由进食去卵白蛋白 不含鸡蛋 的特殊纯种饲料和水 动物房温度 19-25oC 湿度 55-65% 光照 10-12 小时/天 鼠笼每周清洗消毒两次

1 致敏

模型组 分别于第 1 天 第 8 天用新鲜配制的 OVA GradeV 1mg+ AI OH3 200mg+生理盐水 1ml 混悬液在大鼠两腹股沟 腹 前足跖 共 4 点作皮下注射每点 0.2ml 同时一点腹腔注射 0.2ml

2 激发

模型组 于实验第 15 天 将大鼠置于 20cm×20cm×15cm 大小的密闭容器中由 PARI BOY高频雾化器提供雾化动力 以 1%OVA GradeII 进行雾化吸入激发 每次雾化 30min 连续 6 天.

3 观察指标和检测方法

3. 1 外周血单个核细胞(PBMC)的制备及培养

大鼠无菌心脏穿刺采血 2ml 肝素抗凝 吸取血浆 100ìl于-20o冻存待检 IgE剩余部分与等量 PBS 液充分混匀 在一试管中加入适量淋巴细胞分离液 Ficoll用滴管将血液沿管壁缓慢叠加于分离液面上 水平离心 2000rpm×20min 离心后用吸管插到云雾层 吸取单个核细胞 置于另一试管中 加入 5 倍 PBS 液1500rpm×10min 洗涤细胞两次 末次离心后 弃上清 台盼兰染色示活细胞记数在 95%以上 加入含有 10%小牛血清的 RPMI1640 调整细胞浓度为 1×106/ml取上述细胞悬液 1ml 于试管中 加入 ConA 终浓度 5ìg/ml置 37oC 5%CO2孵箱饱和湿度条件下培养 48 小时 离心收集上清 置-20oC 冰箱冻存待检细胞因子

3 .2 支气管肺泡灌洗 BAL 及 BALF 中嗜酸性粒细胞 EOS 百分比记数

大鼠心脏采血致死后 立即充分暴露颈部区域 蚊式钳分离气管 插入 22G留置针 缝线固定 用冷生理盐水 NS 灌洗 反复灌洗 8 次 每次 1ml 回吸率平均在 80% 离心 弃上清 吸取细胞沉渣 50ìl涂片 干燥固定 Diff Quik染色 显微镜下分类记数 2×200 个细胞 依据形态学特点将细胞分为中性粒细胞Neu嗜酸性粒细胞Eos淋巴细胞 Lym 和单核细胞 Mon

3 .3 组织标本留取及组织形态学分析

打开未经支气管肺泡灌洗的大鼠胸腔 观察肺脏的大体病理改变 根据不同用途留取肺组织标本 (1)10%甲醛溶液(用 0.01M PBS 配置)固定 24 小时以上后HE染色.

3 .4 培养上清中细胞因子测定 采用 ELISA 法,见说明书!

3 .5 血浆中 OVA 特异性 IgE 抗体检测,见说明书.