细菌的荚膜染色

（一）实验目的：学习细菌的荚膜染色法：

（二）实验原理：由于荚膜与染料间的亲和力弱，不易着色，通常采用负染色法染荚膜，即设法使菌体和背景着色而荚膜不着色，从而使荚膜在菌体周围呈一透明圈。由于荚膜的含水量在90%以上，故染色时一般不加热固定，以免荚膜皱缩变形。

（三）实验器材

1. 活材料：培养3-5天的胶质芽胞杆菌（Bacillus mucilaginosus,俗称“钾细菌”）。该菌在甘露醇作碳源的培养基上生长时，荚膜丰厚。

2. 染色液和试剂 :Tyler法染色液：（见附二、（一）、14）、用滤纸过滤后的绘图墨水、复红染色液（见附二、（一）、2）、黑素（见附二、（一）、7）、6%葡萄糖水溶液、1%甲基紫水溶液、甲醇、20%CuSO4水溶液、香柏油、二甲苯。

3. 器材： 载玻片、玻片搁架， 擦镜纸、显微镜等。

（四）实验方法

推荐以下四种染色法，其中以湿墨水方法较简便，并且适用于各种有荚膜的细菌。如用相差显微镜检查则效果更佳。

1. 负染色法：

（1）制片：取洁净的载玻片一块，加蒸馏水一滴，取少量菌体放入水滴中混匀并涂布。

（2）干燥：将涂片放在空气中晾干或用电吹风冷风吹干。

（3）染色：在涂面上加复红染色液染色2-3min.

（4）水洗：用水洗去复红染液。

（5）干燥：将染色片放空气中晾干或用电吹风冷风吹干。

（6）涂黑素：在染色涂面左边加一小滴黑素，用一边缘光滑的载玻片轻轻接触黑素，使黑素沿玻片边缘散开，然后向右一拖，使黑素在染色涂面上成为一薄层，并迅速风干。

（7）镜检：先低倍镜，再高倍镜观察。

2. 湿墨水法

（1）制菌液：加1滴墨水于洁净的载玻片上，挑少量菌体与其充分混合均匀。

（2）加盖玻片 放一清洁盖玻片于混合液上，然后在盖玻片上放一张滤纸，向下轻压，吸去多余的菌液。

（3）镜检：先用低倍镜、再用高倍镜观察。

结果：背景灰色，菌体较暗，在其周围呈现一明亮的透明圈即为荚膜。

3. 干墨水法

（1）制菌液：加1滴6%葡萄糖液于洁净载玻片一端，挑少量胶质芽胞杆菌与其充分混合，再加1环墨水，充分混匀。

（2）制片：左手执玻片，右手另拿一边缘光滑的载玻片，将载玻片的一边与菌液接触，使菌液沿玻片接触处散开，然后以30度角，迅速而均匀地将菌液拉向玻片的一端，使菌液铺成一薄膜。

（3）干燥：空气中自然干燥。

（4）固定：用甲醇浸没涂片，固定1 min,立即倾去甲醇。

（5）干燥：在酒精灯上方，用文火干燥。

（6）染色：用甲基紫染1-2min.

（7）水洗：用自来水轻洗，自然干燥。

（8）镜检：先用低倍镜再高倍镜观察。

结果：背景灰色，菌体紫色，荚膜呈一清晰透明圈。

4. Tyler法

（1）涂片：按常规法涂片，可多挑些菌体与水充分混合，并将粘稠的菌液尽量涂开，但涂布的面积不宜过大。

（2）干燥：在空气中自然干燥。

（3）染色：用Tyler染色液染5-7min.

（4）脱色：用20%CuSO4水溶液洗去结晶紫，脱色要适度（冲洗2遍）。用吸水纸吸干，并立即加1-2滴香柏油于涂片处，以防止CuSO4结晶的形成。

（5）镜检：先用低倍镜再用高倍镜观察。观察完毕后注意用二甲苯擦去镜头上的香柏油。

结果：背景蓝紫色，菌体紫色，荚膜无色或浅紫色。

（五）注意事项

1. 加盖玻片时不可有气泡，否则会影响观察。

2. 应用干墨水法时，涂片要放在火焰较高处并用文火干燥，不可使玻片发热。

3. 在采用Tyler法染色时，标本经染色后不可用水洗，必须用20%CuSO₄冲洗。