微流式细胞术

微流式细胞分析术（Personal Flow Cytometry）是采用微毛细管流式技术（Microcapillary）对液流中形成单细胞流的细胞或其它生物微粒（如人工微球，细菌，小型模式生物等）逐个进行绝对计数和快速定量分析的技术。作为下一代的流式检测技术平台，微流式细胞仪诞生于上世纪九十年代。经过近二十年的发展和完善，今天的流式细胞仪已经接近成熟，并被广泛的运用于从基础研究到工业生产的各个方面，涵盖了细胞生物学、免疫学、血液学、肿瘤学、药理学、遗传学及生物能源等领域，在各学科中发挥着重要的作用。

微流式细胞术 - 微流式细胞分析术 - 概述

基于传统流式细胞术，微流式细胞分析术改进了其复杂的液流系统，采用微毛细管技术提高上样效率，显著减少样品用量，摒弃了传统的鞘液流方式。由于微毛细管设计，使每次实验仅需消耗1000-10000个细胞/Test。精确的上样体积使得绝对细胞计数成为可能。

微毛细管技术：样品上样时，由微毛细管与样品液体接触的横截面中心形成的负压区，形成单细胞流上行。注射泵提供稳定精确的上样流与上样体积。由微毛细管和注射泵协同作用形成的单细胞流更加精确与稳定。运行8小时只产生不到50ml的废液；允许检测样本最小上样量仅为1000个细胞；同时无鞘液系统的液流系统成固定状态，仪器操作简单，缩短学习时间，从而提高研究效率。

微流式细胞分析术具备如下特点：

> 稳定的单细胞流，进样过程完全摒弃了鞘液流

> 样本需求少至1000 Cells/Test, 支持低浓度样本检测10 Cells/μl

> 最低实验样本需求量10μl

微流式细胞术 - 微流式细胞分析术 - 简史

17世纪第一台显微镜诞生后，人们开始应用于细胞和组织切片的检查，从此拉开了人类对细胞的科学研究的序幕。到了19世纪末，人们已经可以通过对细胞染色，在显微镜下对细胞的结构进行形态学的研究。到了20世纪40-50年代，由于技术的进步，出现了更先进和更灵敏的荧光显微镜，再加上抗体技术的进展，荧光标记的抗体技术被广泛应用。这一时期单克隆抗体技术的出现，使得人们可以对细胞的表面特异抗原进行识别。人们不仅可以从形态学上对细胞进行分类，更可以根据细胞的特异标志进行细胞亚型的精确分类，以进行更深入的研究。

1934年Andrew Moldaran实现了让悬浮的单个血红细胞通过玻璃毛细管，在亮视野下用显微镜进行计数，并在显微镜的目镜上用光电记录装置对通过的每一个细胞进行计数测量。其后Louis Kamentsky及Melamed等人又对这一技术进行了了的进一步改进。随着20世纪50年代到80年代的发展，流式细胞术被广泛应用于细胞研究，并朝着多参数分析的方向发展。

但随后的20多年里，该技术并无实质性改进。同时由于采用了鞘液流系统和复杂的光路系统，使得机器体积较大，并且加上复杂的软件系统，机器日常使用很不方便，常需要专人对机器进行维护和使用，这就大大限制了流式细胞术在普通实验室的应用。

直到1998年Phillipe Goix博士将最新的微毛细管技术引入流式细胞仪，开创了流式细胞仪的革命性创新。2009年，改进的微毛细管液流系统结合了最新的双激光同步共线性设计，使得机器体积大大减小，再加上创新设计的智能化模块软件系统，让流式细胞术变得更为简单。

微流式细胞术 - 微流式细胞术 - 原理

流式细胞术待测样品(如细胞、微生物、精子或细菌等)经荧光染料染色后制成样品悬液，由微毛细管与样品液体接触的横截面中心形成的负压区，形成单细胞流上行，排成单列的细胞成为单细胞液流，并与入射激光束相交。细胞被激发而产生荧光，通过滤光片组合和光电倍增管进行信号收集。

整个仪器用多道脉冲高度分析器处理荧光脉冲信号和光散射信号。测定的结果用单参数直方图和双参数散点图来表示。

微流式细胞术 - 微流式细胞术 - 应用

免疫学检测

免疫系统是由免疫器官、免疫组织、免疫细胞及免疫分子组成。体内的免疫细胞通常处于静止状态，细胞必须被活化，经免疫应答过程，产生免疫效应细胞，释放免疫效应分子，才能执行免疫功能。免疫细胞分为两类，一类是固有免疫应答细胞，如单核－巨嗜细胞，自然杀伤细胞、多形核中性粒细胞等。另一类是适应性免疫应答细胞：即淋巴细胞，包括T细胞及B细胞。检测各群体淋巴细胞的数量与功能是观察机体免疫状态的重要手段。

细胞凋亡研究

细胞凋亡，即细胞程序性死亡。细胞表面受体、配体、蛋白酶、有丝分裂组分等多种蛋白，这些凋亡信号在细胞内的传递调节着细胞的生存与死亡的精细平衡。这个过程包括了：细胞膜上磷脂酰丝氨酸的外翻，线粒体膜电位去极化，胞内蛋白降解，DNA片段化，细胞膜选择通透性丧失，细胞皱缩等。对凋亡的逃逸，是绝大多数癌症的特征。因此，对凋亡途径的研究有助于找到癌症药物靶点，并分析药物治疗效果。

细胞周期研究

细胞周期是指连续分裂细胞从一次有丝分裂结束到下一次有丝分裂结束所经历的整个过程。在这个过程中，细胞遗传物质复制并加倍，且在分裂结束时平均分配到两个子细胞中去。细胞周期分为DNA合成前期（G1期），DNA合成期 （S期），DNA合成后期（G2期）和分裂期（M期）。细胞周期是调控细胞正常生长、分裂的重要事件。细胞周期的研究有助于揭示抗肿瘤制剂的作用机制。在肿瘤细胞增殖中，细胞周期的调控失效，使细胞无限分裂；反之，若细胞周期调控正常则可迫使细胞从活跃的生长分裂期进入静止的G0期。使用流式细胞仪分析细胞周期的变化已非常普遍

活细胞绝对计数

细胞计数法是用来对细胞悬液中的活细胞、死细胞进行绝对数量计数的一种方法。最早的细胞计数法源于对血细胞计数的需求。法国组织学家Louis-Charles Malassez于19世纪研发的血球计数板是最早的细胞计数器，通过台盼蓝染色区分死细胞与活细胞。随着对细胞生物学的研究不断深入，科学家开始发现台盼蓝并不能区分凋亡细胞与坏死细胞。同时，活细胞的计数结果是通过计算细胞总数和死细胞数获得的。其中任何一个数据不准确，就会导致活细胞计数结果的误差。这种忧虑促成了科学家从20世纪50年代以来，不断对细胞计数仪的开发与探索。

此外，流式细胞术在干细胞研究、藻类研究、线粒体研究等领域中也得到广泛的应用。流式细胞术正在向低成本、高性能、小型化、易用型、获取形态学信息等方向发展