微电泳实验

一、微电极组合的制备

多采用带芯或隔膜的毛细玻璃管以便电极的充灌。可购买已融合成 2~7 管的微管阵列。其优点在于用药物溶液充灌前，仅需将其切成适合长度再用垂直电极拉制仪拉至所需长度和外形。缺点是充灌不同管腔时必须格外小心以避免溶液溢出。

也可以将单个微管自行组合成多管阵列，并通过弯曲其充灌端使之彼此分开。这里介绍的是在 Crossman 等（1974) 的基础上进行了修改的方法。

方 案 1

1.采用热缩管（一种遇热可收缩的材料）作为套管将毛细管牢牢地扎成一束，两道套管的位置分别距毛细管两端约 15 mm。

2.将微管束固定在垂直电极拉制仪的夹头中。通过线圈加热，将磁拉力设为0, 直到微管束软化后开始在重力作用下被拉长。手动加压拉制一小段后，将微管束迅速旋转 270°并停止加热使玻璃冷却。调整线圈位置至锥形扭曲的玻璃束中央。把加热电流和磁拉力调至理想水平，可得到两根可用的多管电极。

3.本生灯（一种煤气灯）加热玻璃管，同时将一根金属钩插入一管的开口端使其弯曲至 30°。除记录电极的微管，其余的微管均按此法弯曲。

4.在弯曲的和未弯曲的微管间涂以熔融的牙科蜡使其形成冠状。这种冠形结构和热缩管套使微管牢固地组合在一起。至此，多管微电极已制成，可以直接充灌并经「折断」处理形成具有合适的尖端直径的电极。

5.将记录电极连接于操纵器和微驱动器，通过它们使微管束进入组织。

用于胞内记录和微电泳的并列式或同轴多管阵列的制作步骤已有详细描述（C urtis1968; O liver 1971; Sonnhof 1973; L a lle y e t a L 1994; R em m ers 1997)。并列电极组装方便且耦合电阻和电容更低。记录电极必须与电泳管束粘合得十分牢固，否则会在组织中彼此分开。同轴排列电极的制备要困难得多，但其优点是记录管和电泳管不易分开。

LaIley 等（1994) 使用的并排微管阵列是依据下列步骤和规范制作的。

方 案 2

1.记录管和微电泳管尖端间的距离控制为 40/m i。

2.用水平拉制仪将胞内记录的微电极拉成所需长度、外形和尖端。通过线圈对记录电极加热，在距尖端 IOmm 处将其折成 15°~20°角。

3.将记录电极折角以下的一段在显微操作（400 倍）下置于微电泳多管阵列中的两管之间的夹缝内。

4.在将两部分组装起来之前，将光敏感牙科黏固剂（3M Corporation, USA) 涂在夹缝中。

5.摆好位置后，用固化枪产生的 900nm 波长光线照射 30s 以固定连接。接着，涂布第二层该黏固剂包裹微管并使其光固化。

6.用颅骨黏固剂在记录电极弯曲处做一个束套，进一步防止微管的分离。

除用作胞外微电泳的标准 5 管阵列外，最终的成品不会造成更多的组织移位。这使其非常适用于记录组织深处神经元的反应（Richter etal. 1996)。

并列的微电极已被 Crossman 等（1974) 用于胞外记录和微电泳，记录电极尖端突出多管阵列 5?15pm。该阵列具有极佳的记录特性，信噪比大，而且据报道，非常适宜记录皮层下小细胞的反应。

碳纤电极

通过将一根碳芯置于多管阵列中的记录电极内，并蚀刻出适合单个细胞记录的精细尖 端（Armstrong-James and Millar 1979; Fu and Lorden 1996) 可以得到用于胞外记录和微电泳的低噪声电极。含两根碳纤电极的多管微电极已用于记录神经元的放电以及测定电泳分离的儿茶酸胺和 5 - 轻 色 胺（5-HT) 浓 度（Armstrong-James etal. 1981;Crepsi et al. 1984) 〇

溶液配制

对于微电泳来说，微电极充灌的步骤和注意事项与第五章中描述的记录电极制备相似。溶液应通过〇.2 押滤膜滤过以除去残渣。微管尖端不应有气泡，否则将阻碍电泳, 而且电流通过充灌溶液时会产生噪声并被记录电极记录下来。建议至少在使用前 10?

15 min 充灌微电极，并将其垂直置于一潮湿的容器内。临用前还应在显微镜下检查微管内是否有气泡和沉淀物，如果有气泡可用一根清洁的猫须在微管中旋转驱除掉。

为利于通过电泳或电渗释放带电荷的物质而不改变该物质的药理学特性，需将溶液调至一定的 PH 值 。单胺类引起神经元兴奋还是抑制，取 决 于 被 激 动 的 儿 茶 酚 胺 或 5-H T 受体亚型。当溶液 pH 为 4 或更低时，它们的神经系统作用倾向于激动（Frederickson et al. 1971); 当 pH 控 制 在 4.5~8 之 间 时 可 基 本 避 免 与 pH 相关的反应。

电极与电泳仪的连接

给微管内液通电采用的是清洁的银丝氯化不是必需的，事实上，氯化银的剥脱会堵住微管尖端从而造成阻塞。为防止银丝间的接触和导电』可将一段 6 0 ~ 7 0 mm 长的银丝焊接到一段 8 〇 mm 长的纤细、柔软的绝缘导线上，再将后者连接到电泳仪上。此绝缘线可安装一接头以连接到电泳仪的探头上。当用于电泳和记录的导线插入微管后，小心地将少量熔融的牙科蜡或石蜡灌注到微管开口上，使它们彼此分开并固定。

微管尖端大小

微管在尖端折断处理前充灌比较容易，但即使在尖端折断处理后也能充灌成功。尖端的折断处理是在显微镜下进行的，用固定在微操纵器尖端的一根玻璃棒触碰微管尖端，使其每一管的尖端直径在 l Mm 左右。这样的电极其尖端电位低。更大的尖端直径会使药物自由扩散增加。

二、记录和微电泳

1.依照第五章中描述的步骤寻找神经元。

2.当微管尖端进入组织后打开电源。一般以 5 ~ 1 0 nA 作为维持电流。加药电流先设在相对较低的水平，如 5nA，然后逐渐增加至 60 ~ 80 nA。此步骤用来检测微管的导通特性。如果有阻塞或过大的噪声，应舍弃该微管束。

3.最好先在其他非靶细胞上检测受试药物和加药电流的有效性。对胞内记录和胞外微电泳来说，由于可能损坏记录电极尖端，这种测试也许不太实际。但还是应尽可能进行。任何未鉴定的神经元，只要有自发电活动而没有损伤性放电就可以用于测试。

4 .微电泳管需通过加药电流预热。有时，一开始即使给予很大的加药电流也引不起反应，这是因为维持电流已使近微管尖端溶液中的药物排空了。这一死腔只有通过反复给予加药电流来填充。可行的方法是，按 照 5 0 % 工作循环的固定间隔给予一逐渐增强的加药电流，直 至 100nA。一旦引起反应，应重复测试数次以确保反应被稳定地激发。这一现象说明微管尖端的药物浓度已达平衡。

5.至此，微管束应置于选定神经元以开始实验。选择能稳定记录的神经元作为靶细胞，出现损伤电流或不能 g 发动作电位的神经元则不应用于实验。在胞外记录的实验中，动 f 电位应 f 负值，且高于背景噪声数百微伏。能记录到孤立的神经元最为理想。如不可行则需采用，波对受试神经元的冲动频率进行计数，在这种情况下，重要的是测试物质只影响神经元。用于胞内记录的受试细胞应具备第五章中所描述的稳定的膜电位。

6 ? 应注 y 防止电流伪迹。除给予的药物外， 电流也能引起反应，特别是当微电泳束靠近神经兀时。假如恰巧在施加电流时，动作电位频率或膜电位突然改变，就应怀疑有电流伪迹，一般来说，正向电流抑制放电和使膜电位超极化，而负向电流则相反—在胞外记录中，如动作电位是负向，则极少出现电流伪迹，说明微管束与细胞间有足够的距离，电流不易扩布至细胞膜。通过平衡电流可将电流伪迹减到最小。给微管束中的一根电极充灌 165mmol/L 的 NaCl, 并用银丝连接到微电泳仪的平衡通道，此通道施加与所有其他微管电流值总和相等但极性相反的电流。第二步，对含 165 mm ol/L NaCl 的微管通电，来检测电流伪迹。

7 . 还需确定给予适当大小的维持电流。通 常 5~1OnA 大小较适宜，但如果细胞对神经活性物质的反应较预期持久，或当改变保持电流的强度时反应随时间变化而变化，就应注意保持电流大小是否适当。一般应避免采用大于 20 nA 的电流，因为它们会在微管尖端造成死腔。