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微压力注射实验

相关实验:微电泳和压力注射技术实验

最新修订时间:

原理

压力注射用于将不带电或带电性弱的物质施加到神经元周围。这种技术对离体和在体实验都很有用。在离体切片标本实验中,相互分开的记录和压力注射微管均置于靠近靶神经元的位置。在原位标本实验中,微压力注射常采用两种方法。

1. 单根尖端相对较粗大(IOum 或更大)的微管,可用于小区域给药(药量为纳升级),以改变神经核团的兴奋性。例如,活体动物实验中,给延髓的呼吸节律产生区域 Pre-Boetzinger 复合体注射纳升级的含 GABA 和甘氨酸受体措抗剂的溶液,用以评价抑制性递质对成年哺乳动物呼吸节律的影响(Pierreficheetal.1998)02. 在胞外和胞内记录中,少于 Inl 的神经活性物质和神经调质可以通过多管微电极束注射到单个的神经元上(Palmeretal.1986;SzenteetaL1990)。

神经活性物质通过微管注射,微管通过软管与压缩气体源(通常是氮气)连接,通过一个开关或 TTL 脉冲控制的电磁阀调节实验要求的压力和持续时间,单脉冲或程序化的系列脉冲均可。

材料与仪器

人工脑脊液
压缩氮气 电磁压力阀 TTL脉冲发生器 毛细玻璃管

步骤

测试步骤与前文所述微电泳方法相同。在将微管集束插入组织前,应检査压力注射 系统的性能。微 管与导管(7 6 ~ 127mm长)之间应该密封牢固。进入组织后要再次对 压力注射系统进行检查。在不同的压力和脉冲持续时间下注射的药物体积应予确定,只 许,应尽量做预实验来观察药物对非靶神经元的作用。 分析方法 分析方法与微电泳相同。 Curtis等 (1971), Hill和 Simmonds (1973)所采用的方 法非常适用于药物相对效能的比较和拮抗剂效应的研究。 计算注射体积和药量 常用的方法是在显微镜下通过刻度测量微管注出的液体长度( L )。在已知内半径 (r ) 的情况下,体 积 ( V ) 可用公S v ^ 7rr2L 计算得到。从已知的浓度可以进一步计 算出注射的药量。然而,药 物 在 靶 部 位 的 浓 度 却 无 法 得 知 ( 参 见 上 文 :浓 度 -距 离 关系)。 注射体积和微电极阻抗 尖端阻抗在1.0~1.4M fl的微电极,在一定压力和持续时间下,在长时间的测试 中仍保持注射体积的均匀性。尖端更细的微管易戳入脑或脊髓组织,而 更 大 的 尖 端 ( 阻 抗 小 于 I .OMn) 则使注射体积不稳定,并且,过大的注射体积似乎易产生体积相关性 反应假:象。 ( Sakai etal. 1979; PalmeretaL 1986)。 假 象 pH值,局部麻醉和其他非特异性作用 在微电泳中出现的反应假象( 伪迹)也会同样在微压力注射中发生。因而以下操作 很 重要: 一尽可能地调节pH值 至 7 • 4。 pH值 小 于 5 • 5 或 高 于 8 的溶液都不应使用
一微管中的药物应予以稀释,浓度最好低至几个微摩尔范围 体积假象 溶液体积可导致损害性放电和膜电位的突然变化。体积太大可把细胞从记录电极冲 走。当神经元放电、膜电位和神经细胞网络联系方式的改变与注射同时发生,应考虑到 体积假象问题。其检验的方法为通过某一管腔注射不含该药物的溶液。 溶剂假象 水以外的溶剂,如乙醇和二甲基亚砜会改变神经元的行为。因此,药物应尽可能地 溶于林格溶液或人工脑脊液中。也应避免使用高渗透压的溶液,因为它们可能会通过胞 浆和细胞外液的药物重新分布来影响神经元的反应

来源:丁香实验

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