药物敏感性实验

互联网2012-09-25

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药物敏感试验简称药敏试验（或耐药试验）。旨在了解病原微生物对各种抗生素的敏感（或耐受）程度，以指导临床合理选用抗生素药物的微生物学试验。

一种抗生素如果以很小的剂量便可抑制、杀灭致病菌，则称该种致病菌对该抗生素“敏感”。反之，则称为“不敏感”或“耐药”。为了解致病菌对哪种抗菌素敏感，以合理用药，减少盲目性，往往应进行药敏试验。

其大致方法是：从病人的感染部位采取含致病菌的标本，接种在适当的培养基上，于一定条件下培养；同时将分别沾有一定量各种抗生素的纸片贴在培养基表面（或用不锈钢圈，内放定量抗生素溶液），培养一定时间后观察结果。

由于致病菌对各种抗生素的敏感程度不同，在药物纸片周围便出现不同大小的抑制病菌生长而形成的“空圈”，称为抑菌圈。抑菌圈大小与致病菌对各种抗生素的敏感程度成正比关系。于是可以根据试验结果有针对性地选用抗生素。

近年已有自动化的药敏试验仪器问世，使试验更加迅速、准确。目前滥用抗生素，致使抗药菌增加，甚至因长期大量使用广谱抗生素，杀伤体内正常微生物，失去微生物的相互制约作用，从而使一些少见的或一般情况下的非致病菌大量繁殖，引起所谓“二次感染”的情况屡有发生，给治疗造成人为的困难。因此，提倡使用药敏试验，坚持合理用药十分重要。

药物敏感试验的方法

目前常用的药敏试验方法有：纸片琼脂扩散法（K-B法）、稀释法、E试验、检测细菌耐药性的方法。稀释法分液体稀释法和琼脂稀释法。

检测细菌耐药性的方法包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的检测、耐万古霉素肠球菌（VER）的检测、耐青霉素肺炎链球菌（PRP）的检测、超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的检测和β-内酰胺酶的检测。

1.实验材料：

1.1普通营养琼脂培养基：可去生化试剂店购买，做不同细菌的药敏试验可选择不同的培养基，如做大肠杆菌的药敏试验可选择普通营养琼脂或麦糠凯培养基。做沙门氏菌可选择血清培养基。

1.2药敏试纸：购买或自制（详见实验准备）

1.3细菌：待做药敏试验的细菌

1.4接种环、酒精灯、打孔器、牛津杯

1.5移液器、滴头

2.实验准备：

2.1药敏片的准备：购买或自制

2.1.1药敏片的制备：取新华1号定性滤纸，用打孔机打成6毫米直径的圆形小纸片。取圆纸片50片放入清洁干燥的青霉素空瓶中，瓶口以单层牛皮纸包扎。经15磅15-20分钟高压消毒后，放在37℃温箱或烘箱中数天，使完全干燥。

2.2.2抗菌药纸片制作：在上述含有50片纸片的青霉素瓶内加入药液0.25毫升，并翻动纸片，使各纸片充分浸透药液，翻动纸片时不能将纸片捣烂。同时在瓶口上记录药物名称，放37℃温箱内过夜，干燥后即密盖，如有条件可真空干燥。切勿受潮，置阴暗干燥处存放，有效期3-6个月。各种常用药的药液配制详。

2.2药液的制备（用于商品药的试验）：按商品药的使用治疗量的比例配制药液；如商品药百病消按其说明量治疗量0.01%饮水，可按这个比例配制药液，可取10毫克加入10毫升的水中混匀。此稀释液即为用于做药敏试验的药液。

3.实验操作方法

3.1药敏片法

3.1.1在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密）

3.1.2将镊子于酒精灯火焰灭菌后略停，取药敏片贴到平皿培养基表面。为了使药敏片与培养基紧密相贴，可用镊子轻按几下药敏片。为了使能准确的观察结果，要求药敏片能有规律的分布于平皿培养基上；一般可在平皿中央贴一片，外周可等距离贴若干片（外周一般可贴七片），每种药敏片的名称要记住。

3.1.3将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

3.2牛津杯法

3.2.1在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密）

3.2.2以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（内径6nm、外径8nm、高10nm的圆形小管，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上，轻轻加压，使其与培养基接触无空隙，并在小管处标记各种药物名称。每个平板可放4-6支小管。待分钟后，分别向各小管中滴加一定数量的各种药液，勿使其外溢。置37℃培养8-18小时，观察结果。

3.2.3将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

3.3打孔法
该法较简单，成本低，易操作，比较适用于商品药物的检测。

3.3.1在“超净台”中，用经（酒精灯）火焰灭菌的接种环挑取适量细菌培养物，以划线方式将细菌涂布到平皿培养基上。具体方式；用灭菌接种环取适量细菌分别在平皿边缘相对四点涂菌，以每点开始划线涂菌至平皿的1/2。然后，找到第二点划线至平皿的1/2，依次划线，直至细菌均匀密布于平皿。（另：可挑取待试细菌于少量生理盐水中制成细菌混悬液，用灭菌棉拭子将待检细菌混悬液涂布于平皿培养基表面。要求涂布均匀致密）

3.3.2以无菌操作将灭菌的不锈钢小管（外径为4毫米、孔径与孔距均为3毫米，管的两端要光滑，也可用玻璃管、瓷管），放置在培养基上打孔，将孔中的培养基用针头挑出，并以火焰封底，使培养基能充分的与平皿融合（以防药液渗漏，影响结果）。

3.3.3加样：按不同药液加样，样品加至满而不溢为止。

3.3.4将平皿培养基置于37℃温箱中培养24小时后，观察效果。

结果观察

在涂有细菌的琼脂平板上，抗菌药物在琼脂内向四周扩散，其浓度呈梯度递减，因此在纸片周围一定距离内的细菌生长受到抑制。过夜培养后形成一个抑菌圈，抑菌圈越大，说明该菌对此药敏感性越大，反之越小，若无抑菌圈，则说明该菌对此药具有耐药性。其直径大小与药物浓度、划线细菌浓度有直接关系。

判定标准

1.药敏实验的结果，应按抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准。

表—1药物敏感实验判定标准

抑菌圈直径（毫米）敏感度

20以上极敏

15—20高敏

10—14中敏

10以下低敏

0不敏

2.药物敏感实验判定标准参考表—1，多黏菌素抑菌圈；在9毫米以上为高敏，6—9毫米为低敏，无抑菌圈为不敏。

影响药敏结果的因素

1.培养基：

应根据试验菌的营养需要进行配制。倾注平板时，厚度合适（约5-6mm），不可太薄，一般90mm直径的培养皿，倾注培养基18-20ml为宜。培养基内应尽量避免有抗菌药物的拮抗物质，如钙、镁离子能减低氨基糖苷类的抗菌活性，胸腺嘧啶核苷和对氨苯甲酸（PABA）能拮抗磺胺药和TMP的活性。

2.细菌接种量：

细菌接种量应恒定，如太多，抑菌圈变小，能产酶的菌株更可破坏药物的抗菌活性。

3.药物浓度：

药物的浓度和总量直接影响抑菌试验的结果，需精确配制。商品药应严格按照其推荐治疗量配制。

4.培养时间：

一般培养温度和时间为37℃8-18小时，有些抗菌药扩散慢如多粘菌素，可将已放好抗菌药的平板培养基，先置4℃冰箱内2-4小时，使抗菌药预扩散，然后再放37℃温箱中培养，可以推迟细菌的生长，而得到较大的抑菌圈。

应用
药物敏感实验后，应选择高敏药物进行治疗，也可选用两种药物协助使用，以减少耐药菌株。在选择高敏药物时应考虑药物的吸收途径，因为我们药敏实验是药液直接和细菌接触，而在给禽用药的时候，必须通过机体的吸收才能使药物达到一定的效果，所以在给禽用药时，高敏药物一定要配合适宜的给药方法，这样才会达到好的治疗效果。