免疫沉淀反应（三）——对流免疫电泳实验

血清蛋白在pH8.6条件下带负电荷，所以在电场作用下都向E极移动。但由于抗体分子在这样的PH条件下只带微弱的负电荷，而且它的分子量又较大（为r球蛋白）。所以游动慢。更重要的是抗体分子受电渗作用影响较大，也就是说点渗作用大于它本身的迁移率。所谓电渗作用是指在电场中溶液对于一个固定固体的相对移动。

琼脂是一种酸性物质，在碱性缓冲液中进行电泳，它带有负电荷，而与琼脂相接触的水溶液就带正电荷，这样的液体便向负极移动。抗体分子就是随着带正电荷的液体向负极移动的。而一般的蛋白质（如血清抗原）也受电渗作用的影响，使泳动速度减慢，但它的电泳迁移率远远大于电渗作用。这样抗原体就达到了定向对流，在两者相遇且比例合适时便形成肉眼可见的沉淀线。

1. 诊断血清：免抗人免疫血清

2. 待检血清：人血清

3. 阴性对照血清

4. pH8.6、离子强度0.05 M 巴比妥缓冲液配方：巴比妥1.84 g，巴比妥钠10.3 g，加蒸馏水1000 ml，调pH至8.6。

5. 缓冲琼脂板：将纯化的琼脂用pH8.6离子强度0.025的巴比妥缓冲液（用0.05 M 的巴比妥缓冲液稀释一倍即可）配成1.5%的琼脂，加入0.01~0.02%流柳汞防腐，保存冰箱内备用。

6. 电泳仪

7. 其他：生理盐水、打孔器、微量进样器

1. 琼脂板的制备根据需要可选用大玻板（6 cm×9 cm）和（小玻片）两种。大玻板约需琼脂10 ml，小玻片约需3.5 ml，凝固后按图打孔，方法同琼脂扩散实验。

2. 加样：左侧孔内加患者血清（原血清及10倍稀释血清各占一孔），右侧内加抗血清，每片应有阳性对照。

3. 电泳

用国产普通电泳仪。其内加0.05 m pH8.6的巴比妥缓冲液，加至电泳槽高度的三分之二处，注意两槽内液面尽量水平。将加好样品的玻板置于电泳槽上，抗原端接负极，抗体端接正极，用2~4层滤纸浸湿作盐桥，滤纸与琼脂板联接处为0.5 cm。以板宽度计算电流，以板的长度计算电压。要求电流量为2~3 mA/cm，即大板为20 mA，小板为10 mA。电压为4~6 V/cm。通电45分钟—2小时后观察结果。

4. 结果观察

在黑色背景上方，用散射光多个角度观察，在对孔之间有白色沉淀线即为阳性对照应出现明显的白色沉淀线。如果抗原，两极微沉淀条纹不清晰，于37℃保温数小时可增强沉淀条纹的清晰度。

5. 影响结果的因素

（1）抗原抗体的比例：抗原抗体比例适应时容易出现沉淀带，反之不易发生。当抗体浓度恒定时，被检血清含甲胎蛋白浓度高时，作10倍、20倍或更高倍数稀释可以提高阳性率。随稀释度的增加，抗原抗体的比例发生变化，沉淀线由靠近抗血清孔向逐步移向两孔中间，并可出现不典型的沉淀线如弧形、八字须形、斜线形，这些也是阳性，应予注意。

（2）组电泳缓冲液其电泳结果以巴比妥钠—盐酸缓冲液灵敏度最高。巴比妥—巴比妥钠次之，Tris缓冲液更差。

（3）电压与电流时电泳时间需要长些：电压电流增大时，电泳时间可更短。但电压过高则孔径变形，电流过大抗原抗体蛋白易变性，干扰实验结果。一般选择5 ml/cm，电泳时间改为1.5小时。