影响紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的因素

紫外吸收法测定蛋白质/DNA浓度的最大特点就是操作简单、测量迅速，而且不需要引入试剂；但是它也面临着很多问题，诸如测量准确性的问题。本节将讨论影响测定的一些主要因素。

（1）蛋白质的不同对测定结果的影响。

由于蛋白质是生物大分子，而紫外吸收往往是其分子内的小基团所引起的，例如酪氨酸、苯丙氨酸，色氨酸和肽键等等。因此当蛋白质不同，其包含的上述小基团含量发生变化时，就会影响蛋白质含量的测定。然而蛋白质种类繁多，结构复杂，很难对其进行有效的归类。例如人体内含蛋白质的种类约有10万种，整个生物界的蛋白质种类估计有100亿种。

建议：测量过程中如果条件允许，应尽量使用相近的蛋白质做标准曲线，修正测量参数，以便得到更为准确的数值。

（2）溶液中干扰物质的影响。

由于蛋白质所包括的具有紫外吸收的小基团为常见基团，其产生紫外吸收的特异性并不强，很多具有类似结构的有机溶剂都会有类似的紫外吸收，如醇、酮、醛、醚、有机酸、酰胺类，这些混入蛋白质溶液都会对测量产生干扰。另外，一些高浓度的无机化合物也会对蛋白质的含量测定产生干扰，例如NaOH、NaCI等等。

建议：测量时应尽量排除干扰物质，同时选择合适的参比溶液。

（3）溶剂吸收的影响。

如果以一些在紫外区有吸收的物质做溶剂（例如醇、酮类），会对测量结果产生很大的影响。

建议：测量时尽量不要使用此类溶剂，或者在测量时选择合适的参比。

（4）PH对测定的影响。

PH变化时对蛋白质含量测定的影响非常大，例如：下图为Tyr的吸收谱线与PH的关系。由图可以发现，PH=6和PH=13时，光吸收度已经有了非常大的差异。

lmax at pH 6: 274 nm

lmax at pH 13: 295 nm

建议：测定样品时不要使溶液处于过酸或者过碱的状态，同时样品的PH值要与标准品的PH值尽量保持一致。

（5）环境极性、蛋白质构象、蛋白质折叠与变性都会对蛋白含量的测定产生影响。