逆转录病毒包装

问：

大家好，请问有人做过逆转录病毒包装吗，我最近在用PT67包装病毒，按照说明书上的要求，在细胞长到70%左右汇合时加入质粒和脂质体和无血清培养液培养4小时后更换为完全培养基继续培养24小时后加300μg/MLG418筛选，现在加药已经36个小时了，可是看细胞长的密密麻麻的大概有100%了吧，还不见细胞往下掉，我真是急死了，300μg/ml的筛选浓度是我在预实验里确定的应该错不了，可是为什么加药以后细胞还不死呢，说明书上说70%汇合时转染后还要继续培养24-36小时再加药，我知道这是要让抗性基因表达，但是24小时的时间细胞都可以长满了啊，会不会把已经转上的细胞淹没了？

答：

我原来做过逆转录病毒，有一些经验，大家多多交流。

通常，当细胞长到70-80%的时候，转染，再过24-48小时后，细胞已经长满（PT-67生长很快）。我采用的方法是：将细胞1：3——1：8传代后，待细胞贴壁或不贴壁（这两个情况我都试过，都能产生克隆），加入筛选浓度的G418（我选的浓度一般是在一周内几乎能把所有野生型细胞杀光）。

通过以上操作，过上一周到两周的时间，都能产生一个一个的细胞克隆团，如果你要求很高，可以挑单细胞做单克隆，如果不太高，可以用滤纸将挑几个克隆团出来，分别培养，然后再维持筛选，最后选用产毒量高的克隆细胞做为逆转录病毒的包装细胞。