核酸含量测定—紫外分光光度法

【 实验目的 】
学习紫外分光光度法测定核酸含量的原理和操作方法

【 实验原理 】
核酸、核苷酸及其衍生物都具有共轭双键系统，能吸收紫外光，RNA和DNA的紫外吸收峰在260nm波长处。一般在260nm波长下，每1ml含1µg RNA溶液的光吸收值为0.022~0.024，每1m1含1µg DNA溶液的光吸收值约为0.020，故测定未知浓度RNA或DNA溶液在260nm的光吸收值即可计算出其中核酸的含量。此法操作简便，迅速。若样品内混杂有大量的核苷酸或蛋白质等能吸收紫外光的物质，则测光误差较大，故应设法事先除去。

【 实验材料 】
1.实验器材

离心机, 离心管,外分光光度计；

(1)钼酸氨—高氯酸 试剂 (沉淀剂)：如配制200ml，可在193ml蒸馏水中加入7ml高氯酸和0.5g钼酸氨。
(2)5%~6%氨水

【 实验操作 】
1．用分析天平准确称取待测的核酸样品500mg，加少量蒸馏水调成糊状，再加入少量水稀释。然后用5%~6%氨水调至pH7加蒸馏水定容到50ml。于紫外分光光度计上测定260nm光吸收值，计算核酸浓度：

式中，A260——260nm波长处光吸收读数；
L——比色皿的厚度，1cm；

N——稀释倍数

2．如果待测的核酸样品中含有大分子核酸，需加钼酸氨—高氯酸沉淀剂，沉淀除去，测定上清液260nm波长处A值作为对照。

取两支 离心管 ，向第一支管内加入2m1样品溶液和2m1 蒸馏 水，向第二支管内加入2m1样品溶液和2m1沉淀剂(以除去大分子核酸)作为对照。混匀，在冰浴中放置，30min后离心(3000rpm)，从第一、第二管中分别吸取0.5m1上清液，用 蒸馏 水定容到50m1。用光程为lcm的石英比色杯于260nm波长处测其光吸收值(A l 和A 2 )。计算核酸浓度：

【 实验结果讨论 】
蛋白质由于含有芳香族 氨基酸 ，因此也能吸收紫外光。通常蛋白质的吸收高峰在280nm处，在260nm处的吸收值仅为核酸的十分之一或更低，故核酸样品中蛋白质含量较低时对核酸的紫外测定影响不大。RNA在260nm与280nm处的吸收比值在2.0以上，DNA的比值>1.8；当样品中蛋白质含量较高时比值即下降。

【 思考 】
1．若样品中含有蛋白质，应如何排除干扰?
2．若样品中含有 核苷酸 类杂质，应如何校正?