普鲁卡因小鼠腹腔注射LD50的测定
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【原理】药物给药剂量与动物死亡率间呈正态分布,以对数剂量为横坐标、死亡率为纵坐标作图,可得到一对称S型曲线,其两端较平坦,中间较陡,说明两端处剂量稍有变化时死亡率的改变不易表现出来,在50%死亡率处斜率最大,该处剂量稍有变动时,其死亡率变动最明显,即最灵敏,在技术上也最容易测得准确,所以人们常选用LD50 值作为反映药物的指标。若将死亡率换算成机率单位,则对数剂量与机率单位呈直线关系,用数学方法可拟合其回归方程式,可精确地计算LD50 及引起任何死亡率的剂量及相关数据。
【器材】注射器(1ml)、天平、小鼠笼、苦味酸。
【药品】盐酸普鲁卡因
【动物】18 ~ 22g健康小鼠50只(正式试验),雌雄各半(雌鼠应无孕),实验前禁食12h,不禁水。
【方法】
1.预试验 目的是寻找引起0%和100%动物死亡的剂量范围,以便正式实验时确定各组剂量。一般是取小鼠9~12只,分3~4组,选择组距较大的一系列剂量腹腔注射给药,观察出现的症状并记录死亡数,找出引起0%及100%死亡率,至少应找出引起20%~80%死亡率的剂量范围,以保证量-效曲线跨越足够的范围。普鲁卡因小鼠腹腔注射(ip)引起0%和100%动物死亡的剂量范围的参考值为:最小剂量(Dmin)121.3mg/kg,最大剂量(Dmax) 290mg/kg。
2.剂量计算及药液配制
(1)剂量计算
根据预试结果找出Dmax及Dmin,设正式实验的剂量组数为n,剂量公比为r,则
各组剂量为Dmax・rk-1 ,k为第几组,一般选用4~5组动物,r为0.6~0.85为宜。
例 已知普鲁卡因Dmin=121.3mg/kg, Dmax=290mg/kg
当n=6时,r=0.84, 各组剂量为:
1. 290 mg/kg
2. 290 mg/kg×0.84 = 243.6mg/kg
3. 290 mg/kg×0.842 = 204.6mg/kg
4. 290 mg/kg×0.843 = 171.9mg/kg
5. 290 mg/kg×0.844 = 144.4mg/kg
6. 290 mg/kg×0.845 = 121.3mg/kg
(2)药液配制
①药源充足时的配药方法
最高浓度药液(母液)的配制
小鼠腹腔注射体积为0.2ml/10g= 20ml/kg,每组药液量为4ml左右,为留有余地,各组动物所需药液体积定为6ml。
求出所需母液体积(V)及母液所需药量(M)
V=各组动物所需药液体积 / (1-r)= 6 / (1-0.84)=37.5ml
M = V ´ Dmax/(20ml/kg)=37.5 ´ (290/kg) /(20ml/kg)=543.75mg
各剂量组药液按下法稀释:
543.75mg+生理盐水至37.5ml,混匀 → 第一组取6ml
↓
31.5ml+生理盐水6ml,混匀 → 第二组取6ml
↓
31.5ml+生理盐水6ml,混匀→ 第三组取6ml
↓
31.5ml+生理盐水6ml,混匀 → 第四组取6ml
↓
31.5ml+生量盐水6ml,混匀 → 第五组取6ml
↓
31.5ml+生理盐水6ml,混匀,为第六组药液
②药源紧张时的配药法
各组所需母液的体积(ml)为:
第一组 6 |
第三组 6 ´ r2 |
第五组 6 ´ r4 |
第二组 6 ´ r |
第四组 6 ´ r3 |
第六组 6 ´ r5 |
母液总体积(V)=6 ´ (1+ r+ r2 + r3 + r4 + r5 )
总药量(M)=母液总体积 ´ Dmax/(20ml/kg)
计算出V、M后,取药量M,用生理盐水稀释至Vml,用移液管精密吸取各组所需的母液量,加生理盐水稀释至6ml,即为各组试验药液。
3.动物分组:将小鼠雌、雄分开。分别称重,同一重量段(如 18.0―18.9g)小鼠放入一个笼内,标记小鼠。雌、雄小鼠分别按重量顺序分层随机分为6组,使不同性别和体重的小鼠能均匀分配于各组,每组10只。
4.给药:各组动物分别腹腔注射相应浓度的药液0.2ml/10g,立即详细观察,记录动物反应情况、死亡时间和数目。在24h内作多次观察,以后每天观察1次以上,连续观察 7~14 天。按Bliss法及其它方法计算LD50 和95%可信限(由于Bliss法计算复杂,可用相关的软件进行处理)。
【结果】记录于表T1-1。
组别 |
剂量 (mg/kg) |
对数剂量 (X) |
动物数 (只) |
死亡动物数 (只) |
死亡率 (%) |
几率单位 (Y) |
LD50 及95%置信限 |
1 |
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2 |
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3 |
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4 |
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5 |
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6 |
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【注意】
(1) 随机性:实验中能控制的因素尽量使之均衡化,难以控制的因素也应力求严格随机化。分组时应先将不同性别分开,再将不同体重分开,然后随机分配,此法称为分层随机分组法。
(2)剂量按几何级数排列,转换为对数后,剂间为等距,便于计算结果,估计误差。相邻高低剂量之比一般为1:0.6~1:0.85,剂距小,结果较精确,但过小易出现反应率颠倒的情况。剂距的大小也与给药途径有关,静脉给药时,剂距可偏小,灌胃给药时可适当偏大。
(3)药物及给药途径应以静脉注射、腹腔注射和灌胃给药为主,选取的途径必须包括推荐临床给药途径。
(4)LD50 受试验中多种因素的影响,如动物的品系、性别、年龄、饥饱以及环境因素中室温、湿度、光照、时辰(上、下午)等。当进行两药的毒性比较时,应尽可能在相同条件下进行,以减少抽样误差。
(5)在试验过程中应详细记动物的中毒症状及可能致死原因,必要时解剖死亡动物肉眼观察,如发现有组织病变时,可进行组织学检查,通常动物死亡多出现在给药后1~2日内,但全部试验应观察7日以上,如遇有迟发性或进行性中毒反应时,需根据实际情况延长观察时间。若发现中毒反应和死亡率对不同动物性别有明显差别,则应选择比较敏感的性别进行试验。
(6)当药物毒性小,以最大浓度和最大体积给药后仍测不出致死毒性时,可测定最大耐受量: 即用临床试验的给药途径,以动物能耐受的最高浓度、最大容积的剂量1次或1日内连续 2 ~ 3 次给予动物(小白鼠至少20只,雌雄各半),连续观察7天,详细记录动物反应情况,以不产生死亡的最大剂量为最大耐受量。