达人推荐：23条多聚赖氨酸实验的经验分享

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本人最近做PC12细胞培养 实验，在接种前需将培养皿用多聚赖氨酸包被，于是到各个网站搜索了一下，发现这方面的实验经验分享真不少，深感好东西不能放在一边发霉，于是特地整理一遍拿来与大伙分享，可能有那么一点点乱，不过都是做这方面的同学肺腑之言，希望与后来者共勉。

注：我只是摘了一个帖子里某段或某句话。一般一段话来自某一位战友。

一、常用的多聚赖氨酸包被可以用三蒸水，或者PBS ，浓度一般为用0.1 mg/ml进行包被。

二、其他常用包被方法比较(以各种免疫 分析为例)：49456826.snap

三、我配成1mg/ml的储存液，用Mini-Q(超纯水)配制，放在-20℃储存，使用时稀释10倍(也用超纯水)，即终浓度100ug/ml，过滤后使用。工作液过滤使用，如一次用不完，放在4℃储存。

多聚赖氨酸在水溶液中易分解，所以一次不要配太多工作液。

四、我现在要配多聚赖氨酸,书上写的用 PBS配,但没写PH,浓度，向各位请教。

答：PH应该在7.0~7.4，PBS：取氯化钠7.650 g，无水磷酸 氢二钠0.724 g，磷酸二氢钾0.210g 溶于蒸馏水1000 mL 中，以1N 氢氧化钠 溶液调pH 值为7.0~7.4，经121℃灭菌15 分钟

五、我准备用多聚赖氨酸涂片培养细胞,不知道多聚赖氨酸涂过的玻片如何灭菌?能否干烤灭菌?

答：Sigma的产品说明书上写的很明白的。

另外，有本书上是这么写的，供参考：

Poly-lysine-coated tissue culture surfaces

To coat coverslips: Prepare a stock solution by dissolving 25 mg/ml polylysine in 4.73 ml water (both poly-L-lysine and poly-D-lysine are used to coat tissue culture surfaces; check specific protocol for choice of isomer) and filter sterilize through a 0.22-μm filter. Store in 100-μl aliquots at ?20°C. When ready to use, dilute one aliquot in 40 ml water to prepare 13 μg/ml working solution. Sterilize coverslips by autoclaving prior to coating. Dip coverslips in the working solution, then incubate 15 min to several hours in a humidified 37°C, 5% CO2 incubator. Allow surface to dry.

To coat culture dishes or 8-well chamber slides: Prepare a stock solution by dissolving 100 mg poly-lysine in 100 ml water (both poly-L-lysine and poly-D-lysine are used to coat tissue culture surfaces; check specific protocol for choice of isomer) and filter sterilize through a 0.22-μm filter. Store in 5-ml aliquots at ?20°C. When ready to use, dilute 1 part stock solution with 9 parts water to prepare 100 μg/ml working solution. Fill tissue culture dishes or slide wells with the working solution and incubate 1 hr in a humidified 37°C, 5% CO2 incubator, then remove solution by vacuum aspiration and allow surface to dry.

Store coated tissue culture ware up to 3 months at 4°C. Use diluted solutions only once, but unused diluted aliquots can be stored up to 3 months at 4°C.

你可以配置好PLL后单独将其过滤除菌，分装，待用。玻片也是事先泡洗洁精，泡酸，双蒸水洗，烘干后高压灭菌，待用。培养的前一天包被培养板时先把玻片放入培养孔然后把PLL加到玻片上，静置15分钟，洗出多余的PLL，然后用高压过的双蒸水洗板，培养板放入37度烘箱里过夜就可以用了。

六、多聚赖氨酸消毒该怎么办?

答：紫外照射消毒我没试过，但用0.22um的滤器消毒是没问题的(小的一次性滤器可以过滤200ml)。在液体消毒时，如果所含成份经过高温，钴60照射发生变性者，建议用滤器(0.22)，多聚赖氨酸为氨基酸类，建议用滤器，如果要求程度高，可以两个滤器过滤两次。

七、资料：多聚赖氨酸溶液(Poly-L-Lysine Solution)Conc.: 0.1% w/v, in water Storage: 18-26℃Thimerosal, 0.01%, added as preservative 多聚赖氨酸溶液是广泛应用的组织切片与玻片黏合剂，该多聚阳离子分子与组织切片上的阴离子相互作用会产生较强的黏合力。

适用组织学，免疫组织化学，冰冻切片，细胞涂片，原位杂交等使用的玻片的防脱片处理，以防实验操作过程中组织掉片。也可用于细胞培养，增加细胞贴壁能力。

八、使用说明

操作步骤(可直接在玻片上涂布)

1.灭菌的ddH2O 1:10稀释该多聚赖氨酸溶液。

2.用之前将稀释的多聚赖氨酸溶液放在室内，使其温度到室温18-26℃

3.将玻片浸在稀释的多聚赖氨酸溶液5分钟。注意增加时间不会提高包被效果。

4.在60℃烘箱1小时干燥，或室温18-26℃过夜干燥待用。

九、注意事项

1.每100mL已稀释的多聚赖氨酸溶液要包被的玻片40-90张， 超过90张片子将影响其黏合力。

2.用之前的玻片必须保持清洁。必要时用含1% HCl的70%乙醇溶液来清洗。

3.不要在用过的稀释液中加新的溶液。

4.释过的多聚赖氨酸溶液要放在2-8℃，至少在3个月内是稳定的。

5.用过的稀释液要过滤，若出现浑浊或长菌要丢弃。

十、将0.5%多聚赖氨酸溶液加入细胞培养皿中，浸泡5-10分钟并自然晾干待用即可。

十一、多聚赖氨酸(poly-l-lysine)：常用包被培养皿的基质之一.。

1.配制硼酸缓冲液(PH8.4)

A液：硼砂溶液--1.907g溶于100ml三蒸水(0.05M)

B液：硼酸溶液--1.237g溶于100ml三蒸水(0.2M)

4.5mlA液+5.5mlB液=硼酸缓冲液(PH8.4)

2.多聚赖氨酸5mg溶于50ml硼酸缓冲液中，配成100μg/ml的多聚赖氨酸溶液。过滤除菌，-20度保存。

3.使用时4倍稀释，可以重复使用3次!

十二、听说一般买来的多聚赖氨酸都是用了做免疫组化时用的，一般都加了防腐剂，不利于细胞培养。所以我以前都是自制鼠尾胶原。请教midas主任，不知道这种说法是否正确?

答:我不知道别的地方PLL的来源，不过我们这里是sigma的粉剂，而且注明是for cell culture。

如果多聚赖氨酸中有防腐剂那么肯定不适合细胞培养!

十三、一些参考书上有的用三蒸水，有的用PBS配置，这与你说的很有出入，是不是三种配法都可以?不知道那一种更合理些?

答：其实都可以，不过这是推荐的方法!(用硼酸缓冲液)

十四、主任，按照您的配方，多聚赖氨酸的使用浓度应该是0.025mg/ml，目前我们实验室的使用浓度是0.1mg/ml，这个浓度来源于上海脑所.我想请问一下，我们用的浓度是否偏高，我培养的是大鼠星形胶质细胞，如果用您推荐的浓度，细胞是否容易贴壁.谢谢!

答：有些文献上也是用的0.1mg/ml，但是我们在实际工作中用0.025mg/ml是完全可以的。

方法是至少包被4h以上，过夜也可以(可重复用3次)!之后无菌水清洗，晾干后即可使用。

用于配养细胞的多聚赖氨酸分子量要求>70,000，一般常见的分子量有70,000～150,000，150,000～300,000和>300,000，分子量越大，黏附力越强，但相对完全溶解较困难，所以我推荐使用150,000～300,000比较好。

多聚赖氨酸的工作浓度各家文献报道相差很大，从0.25 mg/ml到0.01mg/ml都有，因为多聚赖氨酸对细胞有毒性，所以在保证贴附的前提下，浓度越低越好，还省钱。我现在用的是0.01mg/ml。

多聚赖氨酸的配制浓度在各个书上不一，我也在做原位杂交，浓度是0.01mg/ml比较好吧

十五、请问多聚赖氨酸(150000——300000)如何配置?保存?工作浓度?

答：多聚赖氨酸应该是避光保存的.

我们实验室使用的方法如下，希望对你有用：

多聚赖氨酸(Poly-L-Lycine,PLL)

试剂：多聚赖氧酸　　　　　 5g

蒸馏水　　　　　　　　　　 1000ml

配制方法：称取PLL，溶于H2O，充分混合即可，此液浓度为0.5%，可适当稀释配成0.01～0.5%浓度。4℃保存，也可-20℃备用。PLL可反复冰冻，效果无明显影响，工作液常再稀释10～50倍。

我的使用方法如下：

先配制成10mg/ml的浓缩液，使用前按照1：80稀释，制成工作液，浓度25ug/ml,可用于包被培养皿。

十六、各位老师，有几个关于多聚赖氨酸包被培养板的问题请教

1、pll到底溶于硼酸缓冲液还是溶于三蒸水或双蒸水

2、使用前是用灭菌的去离子水稀释吗，可不可以用双蒸水或别的

答：多聚赖氨酸溶于硼酸缓冲液或者无菌培养用水;

多聚赖氨酸包被培养板使用前是用灭菌的去离子水稀释，最好不要用双蒸水或别的，因为多聚赖氨酸包被的原理是通过改变器皿表面的电荷而促进细胞的黏附。

十七、请问：多聚赖氨酸包被培养板和培养瓶时，该注意什么问题?

答：我的方法是：浓度为50ng/1ml的多聚赖氨酸，加入培养板或培养瓶能均匀覆盖底部就可，放置在无菌操作台中过夜。第二天早上用时先用双蒸水冲洗三遍再用。

十八、我的问题是多聚赖氨酸可以在培养瓶中放多长时间，太长了会有影响吗?

答：我曾用过多聚赖氨酸包被培养瓶,但浓度是0.1mg/ml,我都是放一夜,第二天吸掉晾干就用,当然要紫外消一下.我觉得时间长点没什么大碍。

我们这里的老师说，多聚赖氨酸不能用紫外线照射。

1.用赖氨酸包被培养板和培养瓶时，应该选用多聚左旋赖氨酸(分子量为15-30万) ;

2.感觉你“浓度为50ng/1ml”有些低，我一般最后多聚赖氨酸使用浓度达到20-30ug/ml;

3.包被时间一般为6-7h，或者过夜也可;

4.使用时应该先用灭菌水洗三次+PBS(起平衡盐作用)洗一次，洗液的量应该大于包被液的量;

5.“多聚赖氨酸可以在培养瓶中放多长时间，太长了会有影响吗?”，我包被时间最长的经历 有过48h,最后只是多聚赖氨酸随着时间延长蒸发一些而量变少了，但是对细胞生长并无大碍，这是我曾经有过的经历，所以我会负责地告诉你;

6.“多聚赖氨酸能在4度冰箱里放多久?”，最好置于-20度保存，放置数月乃至半年都可以。

我问过博士德公司，他们分装的多聚赖氨酸是用来作免疫组化的，没有做过细胞培养实验，他们不保证能否用在细胞培养中，建议你买其他公司的吧，有固体的，分子量为15-30万，我们实验室用浓度0.01%的来促进神经细胞贴壁。

我们用的多聚赖氨酸浓度为100ug/ml,一般包被3-4小时即可用.我们包被完后一般放在培养箱里,临用时拿出来洗三次，吹干即可.如果不急着用，放在培养箱里较长时间也没关系，把瓶盖拧紧即可，我最长放了2星期也没有问题。

左旋和右旋的多聚赖氨酸都可以用于包被细胞培养器具,主要看你的细胞贴壁能力如何,左旋的更利于细胞贴壁.我们一般使用0.01%浓度的,包被过夜,第二天用双蒸水洗两三次,超净台紫外照射,风干。可以直接买sigma的原装粉剂自己配。还有,配好的多聚赖氨酸在4度时间不能放置太久,大概就一两周吧。存放于-20度中的一般为0.1%的,而且不能反复冻融,只能融化一次。最好是配好后分装。

十九、多聚赖氨酸可用蒸馏水或PBS配制吗?

答：可以的，我们这儿基本上都是用去离子水配制的，这几种方法效果差不多。不知道你是用来做什么的，免疫组化还是养细胞?ihc没什么特别说明，如果是包被瓶皿，那就要注意无菌操作，还有有些普通的多聚赖氨酸加有防腐剂，对细胞有影响的!! (注：sigma公司的产品有注明：used to coat tissue culture surfaces。购买时要注意)

如果是浸泡材料后直接接种细胞的话(多聚赖氨酸有利于细胞帖壁)，我建议你用PBS,因为PBS平衡盐，对细胞损伤小。如果配制后是用来加入培养基的(只是作为其中的一种成份)，可以用三蒸水。

说明书上要求配制及存放要在塑料制品中，忌玻璃制品，用PBS稀释

二十、是否需要一次性滤器滤过一下,用前照一小时?

答：我觉得要是用一次性滤器滤过的东西，就不用再照了。没必要。

二十一、用多聚赖氨酸包被可以减少细胞脱片，根据细胞类型而定，最好用之。以下是我作细胞爬片时步骤：

(1)多聚赖氨酸(PLL)：武汉博士德分装Sigma产品，10ml/瓶。4度存放，有效期1年。

博士德说明书明确指出：多聚赖氨酸一般用干净的塑料器皿，如塑料切片盒，塑料杯等稀释，而不能用玻璃器皿稀释，以免影响效果;在1:10稀释液可以保存在4度里，三个月内仍然可以使用。

因为多聚赖氨酸对细胞有一定毒性，所以在保证贴附的前提下，尽量使用低点儿的浓度。

(2)无菌处理：PLL不可以高温消毒，故应过滤除均，分装于无菌处理的细胞冻存管内，1ml/管，封口模密封，4度保存。另外，准备无菌去离子水50ml。

(3)配置工作液：用移液枪吸取0.3ml PLL+3ml 无菌去离子水，混匀放于10ml无菌塑料离心管中。封口模密封后4度存放。

(4)玻片处理：常规处理的盖玻片，纱布“夹心饼式”消毒、保存。铺片于培养皿中，移液枪将PLL工作液“滴加于”玻片上，室温10分钟后，用消毒好的纱布条吸取玻片上的PLL液。在超静台内风干后使用，或者超静台内过夜晾干，次日使用。

(5)常规细胞消化，离心后爬片。

如果既然细胞生长状态良好，染色时不掉片，可以不用PLL。有些细胞，如神经元就必须要PLL包，要不细胞生长受影响，也会掉片。

二十二、制备多聚赖氨酸盖玻片方法一

用超纯水配成母液浓度为1mg/ml的多聚赖氨酸(Poly-L-Lysine)，分装好以后-20度保存，用的时后再冻融。

方法：

1.吸取约0.25ml滴在无菌的盖玻片上过夜，使多聚赖氨酸粘附在盖玻片上。

2.第二天吸去多余的多聚赖氨酸溶液，把盖玻片依次经去离子水、Tyrode溶液和去离子水浸洗两次。

3.空气干噪并用紫外灯照射15分钟后即可使用(不要求无菌的话操作可简单一些)。

二十三、制备多聚赖氨酸盖玻片方法二

自来水浸2h，浸酸过夜，自来水冲洗干净，95%乙醇浸12h,70度烤干，高压处理，涂一层多聚赖氨酸(0.025mg/ml)，室温包被4h，DD水冲洗10遍，无水乙醇冲洗，超净台风干。盖玻片易碎，处理时动作要轻，还有一次多处理一点，备用。

1.多聚赖氨酸不能高压灭菌，本身就是氨基酸，高压会破坏它的成分。

2.多聚赖氨酸可以紫外照射，包括国外的文献，都说过用之前用紫外照射。

3.做之前要先把游离的多聚赖氨酸洗去。

综观上述，有个别细节问题大家的建议好像不太统一或者我没有找到答案：

1.能否紫外照射铺好多聚赖氨酸的板子?

有战友提到：不能。

其他很多战友提到除过滤外使用紫外灭菌。

2.配好的存储液能否反复冻融?

有战友提到：“多聚赖氨酸在水溶液中易分解，所以一次不要配太多工作液。”

战友提到：不能反复冻融。

没有看到明确说反复冻融无影响的。

23条多聚赖氨酸实验的经验分享，希望能够切实帮到大家。多聚赖氨酸溶液的配制过程中需要注意无菌操作，用PBS配制的多聚赖氨酸溶液会对细胞损伤最小，配完之后四度保存，其他的详细看上文，呵呵