常用染色剂及配制

供组织学诊断用的优秀常规染色剂，不仅须使细胞核和细胞浆有选择性着染，也要使结缔组织着色。苏木素-伊红染色的切片适当分色，可使这些结构得以区分，胞核表现为蓝色，胞浆和结缔组织纤维呈各种色调的粉红，因此这是一种最常用的常规染色剂。

一、苏木素-伊红染色的基本原理

苏木素是最早用于 生物 学上的天然染色剂之一，百余年来，一直是 生物 学实验室最常用的组织学中细胞核的染料，它是从苏木树的树心中提炼出来的，为浅褐色结晶或淡黄褐色的粉末状物。易溶于乙醇、甘油，也可溶于热水。苏木素本身没有染色能力，它经过氧化后，能产生具有染色能力的苏木红，苏木红又称为氧化苏木素或苏木因。

苏木素变成苏木红的过程叫作“成熟”。成熟的方法一般有两种：一种是把配制好的苏木素液在开口瓶中放置两个月以上，让其在日光和空气中的氧的作用下使之氧化。故一般地盛苏木素的瓶子放在向阳处，时间愈长，染色的效果愈好。常配制一大瓶，备长期使用。另一种方法是在苏木素液中加入氧化剂，如磺酸钠，过锰酸钾，氧化汞，双氧水等。用这种方法成熟与用第一种方法者不同的是，它放置时间愈长，染色的效果愈低。这是因为苏木红被继续氧化可生成无色的化合物，故一次不宜配制过多，还应放置40C冰箱内避光保存以延长使用时间。它的优点是配制后即可使用。

成熟的苏木素对组织并无亲和力，须加入含金属离子的媒染剂，才能达到染色的目的。一般用于明矾苏木素的媒染剂为钾明矾或氨明矾。主要是利用明矾中的铝离子和苏木红结合形成的铝沉淀色素为紫蓝色，对染色质有很大的亲和力，水和酒精都不能使其褪色。用于铁苏木素的媒染剂是三价铁离子，苏木红的铁沉淀色素为黑蓝色，不溶于水，因此，故不能配制大量含媒染剂的混合液，一般用时现配，或在染色过程中，先用铁明矾媒染，然后再染苏木素，如磷钨酸苏木素染色即是。

常规苏木素染色的对比染色是用伊红，也有采用焰红，因为焰红比伊红色泽更鲜明，此外还有采用橘黄G，比布里希猩红，波尔多红等作为对比染色。

苏木素-伊红染色，在组织病理学中，是一种日常使用最为广泛的常规染色方法。一张优质的染色切片，可以清晰地观察到各种不同的组织结构以此作为病理诊断的确切依据。再根据此染色切片所见，分别进行不同的特殊染色。

二、染液的配制

在实验室内常用的苏木素染液有以下几种，不同的仅是染色时间以及比较每种染色方法彼此的优缺点，不过各有优劣。

（一）苏木素染液的配制方法如下：

1.Harris氏苏木素液
甲液：苏木素 1g
无水酒精 10ml
乙液：硫酸铝钾 20g
蒸馏水 200ml
丙液：一氧化汞 0.5g

经典的配制方法是，先将甲液加热溶解后，密封待用，再将乙液加热溶解至沸，去火，待溶液仍处于小沸腾状态时再将甲液徐徐倾入其中，全部混合后，再使溶液在短时间内加热至沸腾，去火，最后，将氧化汞缓慢倾入溶液中（氧化汞一定要慢慢少量分次加入，切忌急躁。因氧化汞倒入后，溶液会迅速膨胀易沸出容器外而发生危险。）此时液体变为深紫色，待氧化汞全部放入后，再将溶液加温至沸腾片刻，立即将溶液放入流动的冷水中，并缓缓地连续摇晃至溶液完全冷却为止。隔夜后过滤，加入冰醋酸（按5%比例）混匀，再过滤后保存于冰箱内备用。

我们在实验工作中摸索了一种Harris氏苏木素的配制方法，染色效果很好，特介绍如下。

配方：（配制2000ml）
苏木素 9g
硫酸铝胺（铵明矾） 200g
氧化汞 7g（5—10g）
冰醋酸 100ml
蒸馏水 2000ml

器具：
3000毫升三角烧瓶 1个
200毫升量筒 1个
1000毫升量筒 1个
漏斗 1个（大）
滤纸 1大张
另备脱脂棉、电炉、湿抹布、大称量纸、流水槽等。

（器具要求达到化学洁净）

配法：
1．将苏木素溶于100毫升无水乙醇中，密封备用。
2．将200克铵明矾溶于2000毫升蒸馏水中，加热至沸。
3．去火。加入苏木素酒精搅拌，加热至沸。
4．去火。缓缓加入氧化汞。
5．微火煮至有金属膜产生。
6．去火。以湿抹布包住三角烧瓶的颈部。迅速放置于冷 水浴 中冷却，缓缓摇动烧瓶至液体完全冷却为止。
7．静置避光过夜。棉花过滤。滤液中加入冰醋酸（按5%的比例加入），混匀，滤纸过滤，备用。
注意事项：
1．配制好的苏木素液，未经使用的可长期置冰箱（冷藏）内保存。
2．盛液体的烧瓶要质优并且容积要大，防止忽速冷却对破裂和煮沸时液体溢出。
2.Hansen氏苏木素液
甲液：苏木素　　　　　　　　　　　1g
　　　无水酒精　　　　　　　　　　10ml
乙液：硫酸铝钾（钾明矾） 　　　　20g
　　　 蒸馏 水　　　　　　　　　　　200ml
丙液：高锰酸钾　　　　　　　　　　1g
　　　 蒸馏 水　　　　　　　　　　　16ml
　　先将甲液加热溶解，然后将乙液加热溶解，将甲、乙两液混合。再将丙液溶解后缓缓滴入，待全部混合后，再次煮沸一分钟，冷却后过滤，即可使用。
3.Heidenhain氏铁苏木素液
甲液：硫酸铁铵（紫色结晶）　　　　5g
　　　蒸馏水　　　　　　　　　　　100ml
乙液：苏木素　　　　　　　　　　　0.5g
　　　无水酒精　　　　　　　　　　10ml
　　　蒸馏水　　　　　　　　　　　90ml
　　此液要求硫酸铁铵只有紫色的透明结晶才能使用；苏木素是溶于洒精中然后加水。苏木素液需放置4-5周才能成熟。临用时将甲、乙两液等量混合后使用。（也可先将苏木素用无水酒精配成5%的贮备成熟，用时取10毫升加蒸馏水至100毫升使成乙液）
　　此苏木素液能染许多结构，但只能用于退行性染色法，需要熟练的分化，初学者宜用减半浓度的铁明矾分色，熟悉后再用原浓度分色。
　　此液与其它的苏木素染色技术有两个不同a.媒染剂与苏木素分开使用。b.所用的媒染剂亦用作为分色剂。
4．Ehrilich氏酸性苏木素液
主要应用一般染色和粘液，骨组织的染色
配方： 苏木素 2g
纯酒精 100ml
甘油 100ml
蒸馏水 100ml
冰醋酸 10ml
钾明矾 15g
将苏木素溶于纯酒精，再将钾明矾溶于蒸馏水中，溶解后将甘油倾人混合，然后加入苏木素酒精混合，最后加人冰醋酸，溶液全部混合后，应暴露在日光下使其自然成熟，时间约要三个月。（若加人300毫克碘酸钠，使苏木素迅速氧化则可立即使用。）此液贮存愈久染色力愈强。（可保持数年之久）染色时间5——20分钟，结果甚佳。
5．Delafreld氏苏木素液
主要应用于一般染色，弹力纤维的染色。
甲液： 苏木素 4g
纯酒精 25ml
乙液： 饱和铵明矾水溶液（约 10％）40毫升
丙液： 甘 油 100ml
甲 醇 100ml
先将苏木素溶于酒精，再将甲液混合在乙液中，置于白色瓶中并暴露在阳光下约一周，然后过滤，将丙液加人滤液中，待溶液呈暗灰色时再过滤，滤液密封保存。
6．Mayer氏明矾苏木素液
主要应用于一般染色，骨 组织染色 ，及免疫组化染色。
配方： 苏木素 0.1g
钾明矾 5g
碘酸钠 0.02g
拘椽酸 0.1g
水合氯醛 5g
蒸馏水 100ml
先将苏木素及水煮沸溶解，加人钾明矾与碘酸钠，搅动直到全部溶解为止。再加人水合氯醛和拘椽酸，完全溶解后染液呈蓝紫色。加热煮沸五分钟，冷却后过滤即成。
此染液染切片5——15分钟，不需分化，充分水洗后，可使细胞核显蓝色并且非常细致清晰，通常用于对比染色。
7．Weigert氏铁苏木素液
甲液 苏木素 1g
无水酒精（或 95％酒精） 100ml
乙液 29％三氯化铁水溶液 4ml
蒸馏水 95ml
盐酸 1ml
临用时，取甲、乙液等量混合即可应用。混合时应将乙液加人甲液内，染液呈紫黑色。铁苏木素不能象明矾苏木素一样配制后可放置贮存备用，因铁与染色剂的色素根会化合生成不溶性沉淀，所以铁作媒染液时，必须与染液分别配制和分别保存，染片时临时混合应用。
由于这是一种铁苏木素，它将胞核染成黑色。能抵抗在对比染色液中所含分色剂的脱色作用，且不会被光线退色，因此比钾矾苏木素染色较为持久。
8．Mallory氏磷钨酸苏木素液（PTAH）
配方： 苏木素 0.1g
磷钨酸 2.0g
蒸馏水 100ml
将苏木素于20毫升蒸馏水中加热溶解，再将磷钨酸溶于80毫升蒸馏水。苏木素液冷却后加人磷钨酸溶液中混合，置放人有阳光处数星期至数月才成熟。此液可久放，若急用时可加人0．177克高锰酸钾促其成熟。
该染色剂对神经组织及纤维素是一种较为卓越的染色剂。
9．Mallory氏磷钼酸苏木素液
苏木素 1g
10％磷钼酸水溶液 10ml
水合三氯乙醛 6—10g
蒸馏水 100ml
暴露于阳光下氧化一周，用时过滤。此染色剂主用于中枢神经系统的染色。
10．Bohmer氏苏木素液
苏木素 1g
纯酒精 10ml
钾明矾 20g
蒸馏水 200ml
将苏木素溶于酒精稍加温。钾明矾溶于蒸馏水，两液混合置 烧杯 或广口瓶中，以纱布或棉花封盖，在阳光下约l－2个月自然成熟的苏木素液面可见一层金属膜样物。组织切片染色用5——10分钟，以盐酸酒精分化。
（二）分化液
1％盐酸酒精，是最常用的分化液。
配方： 70％酒精 99ml
浓盐酸 1ml
（三）还原液
1．氢氧化氨液：
配方： 浓氨水 1ml
蒸馏水 99ml
2．饱和碳酸锂液：
配制： 碳酸锂 1g
蒸馏水（冷） 78ml
3．流水冲洗还原。
（四）伊红染液
伊红为砖红色粉末状或酱红色结晶，是最常用的胞浆染料。又名为曙红，它是萤光黄的四溴衍生物。曙红本身溶于醇而不溶于水，也称为醇溶性伊红，它的钠盐，钾盐或铵盐可溶于水，因此称为水溶性伊红。
配方： 伊红Y（水溶） 0.5—lg
蒸馏水 99ml
若取用伊红Y（醇溶性）应溶于99ml75％或95％的乙醇中。若在伊红液中加人0.5毫升冰醋酸，可加速其染色过程，并使胞浆的色泽更为艳丽。