RT-PCR大汇总
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一、RT-PCR
逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
二、RT-PCR具体步骤
详细参考：RT-PCR
三、经验之谈
个人感觉做RT-PCR重要性排序：排第一的是引物，第二的是退火温度，第三才是模板。
逆转录-聚合酶链反应 (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR)的原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。
二、RT-PCR具体步骤
详细参考：RT-PCR
1. 总RNA的提取
见“总RNA的提取”相关内容。
2. cDNA第一链的合成
目前试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScriptTM Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。
（1） 在0.5 ml微量离心管中，加入总RNA 1-5 μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11 μl。在管中加10 μM Oligo（dT）12-18 1 μl，轻轻混匀、离心；
（2）70 ℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1 min；
（3） 取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 μl；上游引物（10 pM） 2 μl；下游引物（10 pM） 2 μl；dNTP(2 mM) 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl） 1 μl。轻轻混匀，离心。42 ℃孵育2-5 min；
（4）加入SuperscriptⅡ1 μl ，在42 ℃水浴中孵育50 min；
（5） 于70 ℃加热15 min以终止反应；
（6）将管插入冰中，加入RNase H 1 μl ，37 ℃孵育20 min，降解残留的RNA。-20 ℃保存备用。
3. PCR
（1）取0.5 ml PCR管，依次加入下列试剂：第一链cDNA 2 μl；上游引物（10 pM）2 μl；下游引物（10 pM）2 μl；dNTP(2 mM) 4 μl；10×PCR buffer 5 μl；Taq 酶（2 u/μl）1 μl；
（2）加入适量的ddH2O，使总体积达50 μl。轻轻混匀，离心；
（3）设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照；
（4）电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果；
（5）密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。
三、经验之谈
个人感觉做RT-PCR重要性排序：排第一的是引物，第二的是退火温度，第三才是模板。
1. 引物
引物可以自己设计或者参考自名牌期刊，如5分以上的或本专业排名前四的期刊。因为这发表在这些期刊上文章的作者没有必要在方法学上造假，所以他们提供的引物序列是可信的。建议大家针对同一基因设计或者查找2对不同引物序列，合成一对引物时最好找2家不同的生物公司合成此物，如英俊（invitrogen），上海生工等。
具体原因是，引物合成不可避免有一定的错误率，国际上公认的是0.3%到0.5%，在中国大陆的生物公司由于偷工减料，错误率更有可能达到1%！既然我们选择了化学合成法合成引物，就要承担这个错误率。这就好比青霉素是治疗感染的好药，既便宜又管用，但只要注射青霉素，就存在过敏性休克的可能性。但2家不同的生物公司合成同一对引物出错的概率那几乎可以说是0了，这就是为什么要找2家生物公司合成引物的原因，节省了时间，加快了实验进度，表面上看浪费了钱，考虑摸索条件时其它试剂的开销其实节省了钱，总的来说既节省了钱又节省了时间。
2. 退火温度
若有梯度PCR仪摸索条件方便多了，一次可以摸索10个退火温度，一天就能摸索好条件，若一种引物摸索了10个退火温度还没有看见目的条带的话，那应该果断地放弃这个引物，采用其它引物，千万不要在一条引物上吊死，那样会浪费很多时间和金钱，那怕它的序列出自于nautre，science，原因可能是引物合成时的突变。我一般采用的反应如下：
10X Taq buffer 5 ul
10mM dNTP 1 ul
25mM MgCl2 3 ul
Taq酶(1u/ul) 1 ul
正义引物 1.5 ul
反义引物 1.5 ul
模板 2 ul
超纯水 35 ul
本人用的试剂除了引物、dNTP外全部是fermentas（MBI）品牌的，原因很简单，fermentas（MBI）质量很好，价格又便宜，500 U的Taq酶才卖130元，和国产试剂差不多，但发文章尤其是SCI期刊时写fermentas(MBI)的名字很有面子的；引物是英俊（invitrogen）合成的；dNTP是promega品牌大陆分装的，很便宜1 ml 的10 mM dNTP才130元 。10X Taq buffer我一般用fermentas（MBI） Taq酶（货号EP0404）附带的硫酸铵（(NH4)2SO4），氯化钾没有用过。
预变性94度3分钟；然后变性94度30 秒，退火做从50度到60度的10个梯度30秒，延伸72度45秒共35个循环；最后总延伸72度10分钟。摸索条件时一般用8ul产物上样电泳。
只要有目的条带可以说就已经成功了90%，至于什么引物二聚体，非特异性扩增，可以通过调整引物的量、模板的量、镁离子来解决。若没有目的条带，调整引物的量、模板的量、镁离子纯属瞎闹。
3. 模板
提取总RNA和逆转录时大家只要严格按照试剂盒的说明书操作就行了，没什么技巧。提取总RNA我用英俊（invitrogen）的Trizol，量一定要够。逆转录我用fermentas（MBI）的逆转录试剂盒（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit），货号K1622，很好用，加好样后，按42度60分钟、70度5分钟反应就行了。这个试剂盒还提供了一对人、大鼠、小鼠通用的GAPDH内参，496 bp，58度退火温度。序列如下：
正义5-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3
反义5-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3
