临床微生物SOP

Ⅰ高压锅使用的标准操作程序（SOP）

实验室名称	项目	编号	制定日期

【目的】

确保高压效果的可靠性。

【适用范围】

蒸气式高压锅。

【该SOP变动程序】

本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。

【操作方法】

1．将水加到高压锅内至其刻度线，将欲灭菌物品放入锅内，关闭锅门，拧紧螺丝并确认已经封闭。

2．打开排气阀。

3．打开蒸汽开关，向锅内输入蒸汽或接通电源，使产生蒸汽。

4．观察排气阀的排气情况，待排出的气体由冷气变为蒸汽，压力表达到0.05mPa时，关闭排气阀。

5．观察压力表，当压力升至0.15mPa时，开始计时。

6．压力达0.15mPa后，可调节进气阀，减少进气量，维持压力并使其稳定在0.15mPa。电加热时，可切断电源，维持压力持续15分钟，至多不超过30分钟，否则营养物质破坏。

7．关闭进气阀门或切断电源，让锅内物品自然冷却，不可马上打开排气阀，以免发生意外。

8．待锅内压力降为零时，可打开锅盖，取出物品。

Ⅱ培养箱使用的校准标准操作程序（SOP）

实验室名称	项目	编号	制定日期

【目的】

   确保培养箱温度恒定。

【适用范围】

   各种类型隔水式、温度设定为27℃、35℃、42℃、56℃培养箱。

【该SOP变动程序】

   本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。

【操作方法】

1．培养箱应放置于水平地面（或坚固的水平台），电源电压须匹配。

2．从注水口先将隔水箱内的水注满到浮标要求的位置。

3．将温度调节旋扭调至所需温度，然后将电源开关拨至“开”处。

4．每次使用时应在培养箱顶部插入标准温度计，监测实际温度。

5．培养箱工作温度波动范围应控制在±1⁰C以内。

6．培养箱正面贴有温度记录表，记录每天上班和下班时温度，如温度超出正常范围，指示该温度的刻度应划上红圈，并把修正温度记录下来。

7．培养箱内外应保持清洁。

 

Ⅲ 培养基制备的标准操作程序（SOP）

实验室名称	项目	编号	制定日期

【目的】

保证培养基的质量。

【适用范围】

使用成品培养基干粉制备各种分离培养基。

【该SOP变动程序】

本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。

【步骤】

1.在玻璃容器中加入所需蒸馏水的二分之一量，然后放入一定量培养基干粉，补足水量，轻轻搅拌以促进溶解。

2.校正pH：高压灭菌前可用pH计或精密pH试纸校正培养基的pH。

3.分装：液体培养基一般在灭菌前分装，分装时应注意每管的分装量不应高于试管的2/3。琼脂平板是在培养基高压灭菌后冷至50-60⁰C时再倾注平板。

4.质量检查

[1] 无菌试验：将制好的培养基在35⁰C孵育过夜，判定是否灭菌合格。

[2] 效果检验：按不同的培养要求，接种相应的菌种，观察细菌的发育、菌落形态、色素、溶血等特征，判断培养基是否符合要求。

5.保存：液体培养基及琼脂平板须在4⁰C保存，一般不超过7天，如用塑料袋密封至多保存2周。

 

 

 

 

Ⅳ 革兰染色的标准操作程序

实验室名称	项目	编号	制定日期

【目的】

确保染色结果清晰可靠。

【该SOP变动程序】

本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。

【试剂】

1.结晶紫溶液

A液：结晶紫      2g    

         95%乙醇    20ml

Β液：草酸铵   0.8g

          蒸馏水   80ml

使用前24小时将A液Β液混合后，过虑后装入试剂瓶内备用。

2.碘液

碘       1g

碘化钾   2g

蒸馏水   300ml

3.脱色液：95%乙醇

4.复染液

储存液：沙黄      2.5g

        95%乙醇  100ml

应用液：储存液   10ml

        蒸馏水   90ml

【方法】

1.待检标本用无菌生理盐水涂片，经自然干燥或火焰固定。

2.加结晶紫液染1分钟，清水冲去染液。

3.加碘液染1分钟，清水冲去染液。

4.加95%乙醇脱色液，不时摇动约10-30分钟，至紫色已脱落为至，水冲洗。

5.加复染液（伊红），染30分钟，水冲洗。

6.待涂片自然干燥后，油镜镜检。

 

 

 

 

Ⅴ 抗酸染色的标准操作程序

实验室名称	项目	编号	制定日期

【目的】

确保染色结果清晰可靠。

【方法】

（一）碱性复红染色法

【试剂】

1、萋纳石炭酸复红溶液

碱性复红乙醇饱和溶液 10ml

5%石炭酸溶液        90ml

2、脱色剂

浓盐酸        3ml

95%乙醇      97ml

3、复染液（吕弗勒美蓝液）

美蓝乙醇饱和溶液     30ml

10%氢氧化钾         0.1ml

蒸馏水               100ml

【染色步骤】

1、  涂片经自然干燥或火焰固定后，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾。染5分钟（若染色奴卡菌需要加长时间），水洗。

2、  加脱色剂，不时摇动坡片至无红色脱落为至，水洗。

3、  加复染液，染0.5-1分钟。

4、  干后镜检。分枝杆菌呈红色，背景为蓝色。

注：奴卡菌、放线菌标本染色时，脱色剂改用2%硫酸水溶液。

（二）金胺O-罗丹明Β染色法

【染剂】

1、              罗丹明Β液：罗丹明Β 0.1g加蒸馏水100ml；

2、              0.1%金胺O液：金胺O  0.1g加蒸馏水95ml，再加入纯石炭酸5ml，混匀。

3、              3%盐酸酒精。

4、              稀释美蓝液：吕弗勒美蓝液10ml，加蒸馏水90ml，混匀。

【方法】

1、涂片固定后加第1液30-90分钟。

2、弃去第1液后加第2液染15分钟。

3、用第3液脱色1-2分钟，水洗。

4、滴加第4液染30分钟，水洗，待干，荧光镜检。

【结果】

抗酸菌在暗背景中呈现金黄色荧光。

 

Ⅵ 血培养标本采集的标准操作程序

实验室名称	项目	编号	制定日期

【目的】

指导血液标本的正确采集。

【该SOP变动程序】

本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。

【步骤】

1.选择一适当的静脉穿刺处，先以70%酒精擦拭。

2.再用棉签沾取2%碘酊涂于欲作静脉穿刺处，让其干后再用70%酒精擦拭。

3.全部手续再作一此（如必要）

4.用一支无菌的21号针头与10ml针筒抽空（成人约抽取10ml血液，小孩约抽取1-5ml）。

5.血液抽出后，立即注入血液培养瓶，马上充分混匀后，再送入检验。

 

 

Ⅶ 血液及骨髓微生物学检验的标准操作程序（SOP）

实验室名称	项目	编号	制定日期

【目的】

保证血（骨髓）培养结果的正确性。

【该SOP变动程序】

本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。

【实验条件】

培养箱或厌氧培养箱（或厌氧罐）或全自动血培养仪。

【操作程序】

（一）标本采集

严格无菌技术取血液10ml（儿童血液1-5ml）、骨髓0.5-1 ml注入血培养瓶后立即送实验室，注入厌氧瓶时要注意勿将注射器内的空气注入瓶内，培养瓶在送试验室前，不可放冰箱暂存。

（二）培养

1.实验室接到血培养瓶后，放35⁰C孵育。

2.经过12-18小时，35⁰C孵育后，在血平板或巧克力平板上盲传一次。

3.盲传后继续孵育，每日早晨观察有无细菌生长，直至第7天。

4.无细菌生长表现的培养瓶，在观察的7天中，最少应做2次盲目传种。

5.全自动血培养仪培养时，待其仪器报警，涂片、接种；若仪器未报警，5天后盲种，仍为阴性，才能报告。

（三）分离鉴定

1.盲传阳性或肉眼可见生长现象，直接涂片做革兰染色，所见结果应及时报告临床医师。

2.根据涂片结果，如为一种细菌生长，则直接以增菌液做鉴定实验；如有两种或多种细菌同时生长，则必须经过分离培养，以获得纯菌种后做鉴定。

3.细菌鉴定要做到种的鉴定。

（四）药敏实验

1.根据涂片结果，直接以培养瓶内的增菌液做直接药物敏感性测试，争取在较短时间内得出初步结果，供临床医师作为治疗的参考。

2.标本经平板分离纯培养后，做标准化药敏实验正式报告给临床。

【结果的判断】

1.疑有细菌生长者，经涂片、革兰染色镜检后，电话通知主管医师。

2.任何时候平板上长出单个菌落，应立即完成鉴定就及标准化药敏实验，并发出报告，报告形式为“    XXX细菌生长”，药敏实验报告形式为“XXX敏感”等。

3.培养3天为阴性的标本，应电话通知临床医师，培养7天仍为阴性者，应报告“经7日培养无细菌生长”。

 

保证质量评价的准确可靠。

【作用】Ⅷ 药敏试验的标准操作程序

实验室名称	项目	编号	制定日期

一、K—B法

【目的】

保证纸片扩散法药敏结果的可靠性。

【材料】

（一）培养基

Mueller-Hinton琼脂平板，只适合肠杆菌科、铜绿假单胞菌、不动杆菌、葡萄球菌、肠球菌、霍乱弧菌；HTM琼脂，只适合嗜血杆菌；GC琼脂＋1％特定的生长因子，只适合淋病奈瑟菌；Mueller-Hinton琼脂＋5％羊血，只适合链球菌。

（二）药敏纸片

抗菌药物纸片直径约为6.0-6.35mm，每片的吸水量约20ml。

（三）质控菌株

K-Β法质量控制用菌株常规用：金黄色葡萄球菌ATCC25923、大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853。

（四）菌液比浊管

接种菌液浓度为1.5x10⁸/ml，相当于0.5的麦氏比浊管。

【方法】

1.制备接种菌液：挑选琼脂平板上，形态相同的菌落移种于M-H液体培养基中，置35⁰C温箱中孵育4小时，校正浊度，或用接中环挑取菌落，置浮于生理盐水中振荡混匀后与标准化浊管比浊，调整浊度与比浊管相同。

2.接种平板：用无菌棉签蘸取已制备好的接种好的菌液，在管壁上旋转挤压九次，去掉过多的菌液，涂布整个M-H培养基表面，并将平板旋转60℃，反复几次，最后沿平皿周边绕两圈，保证涂布均匀。

3.贴纸片：待平板上的水分被琼脂完全吸收后（约15分钟），用无菌镊子取纸片贴在琼脂平板表面，并用镊尖轻压一下，使其贴平。每张纸片间距不少于24mm，纸片中心距平皿边缘不少于15mm。

4.孵育：把贴好药敏纸片的平皿放进35⁰C孵平板，最好单独摆放，不超过2个叠在一起，孵育18-24小时后，读取结果。

5.判定结果：培养后取出平板，用游标卡尺测量抑菌环的直径，抑菌环的边缘以肉眼见不到细菌明显生长为限，然后根据抑菌环直径大小、NCCLS判断细菌的敏感性，并加以记录。

 

二、稀释试验

【目的】

1.为了决定抗生素的最低抑菌浓度（MIC）。

2.为了决定抗生素杀菌能力，或实验两种以上抗生素对细菌的协同作用或对抗作用。

【方法】

（一）肉汤稀释试验

1.适用情况：

[1] 血液培养。

[2] 病人对适当治疗方法无效。

[3] 免疫机能障碍病人

[4] 病人经治疗后复发者。

2.培养基的选择：

一般细菌用调节好阳离子的M-H肉汤（CAMHB），如肠杆菌科、铜绿假单胞菌、不动杆菌、葡萄球菌、肠球菌、霍乱弧菌；某些挑剔性细菌则根据其生长的营养需要，向M-H肉汤中加入适当的营养物进行实验，如HTM肉汤，只适合嗜血杆菌；CAMHB＋2－5％冻融马血，适合肺炎链球菌以及以外的链球菌。

3. 肉汤的连续稀释：

[1] 将各种抗微生物药物库存液稀释成200ug/ml或200u/ml。

[2] 取10支无菌试管，写上编号1-10，为一组每种抗生素需一种。

[3] 自第2管至10管各加入无菌肉汤1。0

[4] 将各实验药分别加1.0ml至第1管及第2管，将第2管混匀后移取0.1ml至第3管，同样操作，倍比稀释至第9管，第10管不加抗生素作为阳性生长对照。

[5] 另外准备仅含肉汤的试管，作为阴性对照。

4.细菌的接种

[1] 每支试管接种1.0ml菌液（约10⁵-10⁶个细菌/ml），也可将细菌调至0.5个麦氏浊度再用肉汤稀1：200然后接种1.0ml至每支试管内。

[2] 接种后每支试管含混合液，抗生素浓度为512ug（u）-O.125ug（u）。

[3] 若细菌对某种抗生素特别敏感，可把操作液先稀释10倍，再予连续2倍稀释，最后的浓度为10；5；2.5；0.6；0.3；0.15；0.08；及0.04ug/ml。

5.培养和结果的判断

在35⁰C温箱中培养16-20小时后，肉眼观察生长情况，阳性对照管可见浑浊生长，阴性对照管则应清澈。

  以抗生素能抑制细菌生长管的最低浓度为其MIC值。

6.测量最低杀菌浓度（MBC）

把无菌生长的每一试管吸0.1ml加到50⁰C的胰蛋白胨肉汤（Tryptic soy broth,TSA）20ml混合均匀后分别倒平板，培养48-72小时后计算菌落数，和1：200稀释原菌液作倾注获得的细菌数相比，减少99.9％，其最小抑菌浓度为可得到抗生素的MBC值。一般在实际运用中，采用定量接种环（0.001毫升）涂化平板，孵育后，平板菌落计数小于5个，其抑菌浓度为最小杀菌浓度。

7.质控：利用NCCLS建议的标准菌株进行质控。

（二）微量肉汤稀释敏感实验

手工法：原理与试管稀释方法相同。具体操作是在含有96小孔的小塑料培养盘进行，每一孔可装0.1ml量，每一盘可同时作数种抗生素的数种不同浓度，另2孔作为阳性与阴性对照。

仪器法：配制仪器Minidiluter或MIC-2000（美国）Dynatech labortories，Alexandria，VA）自配或购买现成的实验培养基。

（三）琼脂稀释法

1此法与肉汤稀释实验原理相同，但又有其优点：①可同时实验许多菌株，利用多点接种仪可同时接种多个菌株到一系列含有各种不同抗生素浓度的平板。②可检测是否污染：由细菌在平板上生长的特性判断。③可对肉汤稀释实验结果不佳的挑剔性细菌进行实验。

2.琼脂培养基的选择：一般使用M-H琼脂，它适合肠杆菌科、铜绿假单胞菌、不动杆菌、葡萄球菌、肠球菌、霍乱弧菌；对挑剔的细菌可加入相应的营养物，如巧克力、动物血、5%脱纤维血或冷冻动物血等，如HTM琼脂，只适合嗜血杆菌；GC琼脂＋1％特定的生长因子，只适合淋病奈瑟菌；Mueller-Hinton琼脂＋5％羊血，只适合肺炎链球菌以外的链球菌。

3.抗生素稀释与平板的配制。

4.平板的接种：

[1] 每一试验菌株需调整浓度至0.5麦氏浊度。

[2] 平板点接种可用定量接种杯（0.001ml）、毛细吸管或自动接种仪器进行。

同时作5个对照菌株作为质控：大肠埃希菌ATCC25922、大肠埃希菌ATCC35218、金黄色葡萄球菌ATCC29213、粪肠球菌ATCC29212。

5.待接种菌液被完全吸收后，倒置培养在35⁰C温箱内。

6.结果的判断：16-20小时后，首先看不含抗生素的对照平板，必须有一株生长，然后看各实验平板，凡能完全抑制细菌生长的抗生素最低浓度即为MIC值。

 

 

Ⅸ 药敏实验室内质量控制的标准操作

实验室名称	项目	编号	制定日期

【目的】

保证药敏报告的准确性，可靠性及重现性。

【该SOP变动程序】

本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任。

【适用范围】

琼脂纸片扩散法。

【方法】

一、培养基

纸片扩散实验必须使用M-H琼脂培养基，因为它不含抑制磺胺药物，而其他种类培养基可能含有与磺胺药拮抗的物质，使其抑菌环变小。

1.培养基的制作过程必须统一，无论是培养基或添加物的剂量、PH值、高温灭菌的时间或温度都需遵照规定，

2.新的粉状脱水培养基打开时，要附厂商、编号、日期、及打开者的姓名。

3.无菌实验：每一批配好的培养基其中抽取5%的量在 35⁰C或其他适合的温度下隔夜培养，观察有无菌落生长。

4.若是新购的培养基必须观察其颜色与透明度，若有沉淀、浑浊或脱水的现象都必须丢弃，新配好的M-H培养基，用塑料袋包好，储藏于4⁰C的水箱内，防水蒸发。

5.平板所含培养基的量太多或太少均不宜，如Mueller—Hinton agar的高度不可超过4mm，否则会影响抑菌环的直径（变小）。

6.定期检测培养基的有效性，并对结果加以记录，以便能随时发现问题。

7.培养基要在有效期内使用。

二、试剂

   鉴定细菌实验所用的纸条或纸片，储藏于冰箱时，须附干燥剂，且须注意所标明的有效期限。纸片购入时须作阳性与阴性对照以检查其是否有效，以后可每周做一次。

三、抗生素粉末与抗生素纸片

  检查室诊断过程中所用抗生素粉末必须保持干燥，置冰箱储藏，若其制成高浓度的库存溶液，应该采取少量分装于各小瓶，贮存于-14⁰C或-14⁰C以下，一旦取出解冻，未用完的就应丢弃。若抗生素粉末用于稀释试验时，须限已知MIC的微生物作对照。

    作药敏用的抗生素纸片应放干燥剂并贮存于-14⁰C或-14⁰C以下，若情况不允许，除了penicillins、cephalosporins及oxacillin纸片仍必须冰冻外，其余可置冰箱贮存。从冰箱取出装抗生素纸片的容器，须待其复温至室温后才能打开使用。

    每天在作药敏试验时，最好同时取已知敏感的微生物质控菌株作对照，来测验纸片的功效。

四、装备

1．培养箱、冰箱等装备于每天早上上班时须记录温度并校正，使用过程中应注意温度有无变化。

2．CO₂ 培养箱，要确保其所含的CO₂量。

3．厌氧缸在使用时，催化剂要先在160⁰C干燥箱中加热1-2小时，使其恢复功能，且同时于缸中放入生物指示剂可确定是否绝对无氧。

五、操作人员素质

操作者应熟悉药敏试验的规范步骤，尤其要注意其影响因素，如：接种菌的浓度不能太高或太低，应标准化；接种要用无菌棉拭子，不可用接种针或接种环，且要使接种菌在平板上分布均匀；纸片间距要合适等。

六、结果判读

纸片扩散敏感性试验只适用于快速生长菌，不可用于缓慢生长菌，一般培养16-18小时后读取结果。并根据NCCLS抑菌环的判读标准判断药物的敏感与否，但要注意NCCLS的标准常因菌种而异。

 

 

 

 

Ⅹ 微生物学检验室间质评的标准操作程序（SOP）

实验室名称	项目	编号	制定日期

【目的】

1.综合判断实验室的工作水平。

2.作为实验室外部的一个公众质量控制标准。

【该SOP变动程序】

本标准操作程序的改动，可由任一使用本SOP的工作人员提出，并报经下述人员批准签字：专业主管、科主任

【方法】用模拟临床标本做质量评价

将细菌接种在培养基或制成冻干菌种，并把它当作某种临床标本，发给各个实验室。各个实验室根据该标本的性质及有关模拟的临床指征，按照日常的操作方法进行相应的分离鉴定及药敏试验，结果回报给组织机构，经过统计分析后再反馈到实验室。根据反馈的资料，实验室可以做自我评价。组织机构在反馈的资料中，可以根据各个实验室的检验结果给出所计算的得分，作为评价时的一项比较直观的指标。

（一）用日常临床标本的检验结果做质量评价

用于日常临床标本的检验结果做质量评价的指标有两方面：

1.细菌分离率：各类感染的病原菌特点相对稳定。比如急性呼吸道感染，常见的病原菌是肺炎链球菌和流感嗜血杆菌。分析一个实验室对呼吸道标本该类细菌的分离率，可判断其对呼吸道细菌感染的诊断能力。实验室很少或分离不到此类细菌，说明有漏检和误诊。

2.细菌耐药率：细菌的耐药性也相对稳定，社会上有公认的耐药率。比如，金黄色葡萄球菌对青霉素G的耐药率达90%，对万古霉素无耐药或耐药率很低。一个实验室的检验结果如果与其他实验室的结果不同，应做质量分析。