大肠杆菌感受态细胞的制备、重组DNA的转化、克隆筛选

4．操作步骤

1）大肠杆菌感受态细胞的制备(CaCl2法)

(1) 从新活化的E.coli DH5α菌平板上挑取一单菌落，接种于3～5ml LB液体培养中，37℃振荡培养12h左右，直至对数生长期。将该菌悬液以1:100～1:50转接于100ml LB液体培养基中，37℃振荡扩大培养，当培养液开始出现混浊后，每隔20～30min测一次OD600nm，至OD600nm≤0.5时停止培养；

(2) 每组取培养液3个2ml转入2ml离心管中，在冰上冷却20-30min，于4℃，4000r／min离心10min（从这一步开始，所有操作均在冰上进行，速度尽量快而稳）；

(3) 倒净上清培养液，用1ml冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液轻轻悬浮细胞，冰浴；

(4) 0～4℃，4000r／min离心10min；

(5) 弃去上清液，加入500µll冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞。0～4℃，4000r／min离心10min；

(6) 弃去上清液，加入100µl冰冷的0.1mo1／L CaCl2溶液，小心悬浮细胞，冰上放置片刻后，即制成了感受态细胞悬液；

(7) 制备好的感受态细胞悬液可直接用于转化实验，也可加入占总体积15％左右高压灭菌过的甘油，混匀后分装于1.5ml离心管中，置于-70℃条件下，可保存半年至一年。

2）细胞转化

(1) 分别取3个100µl感受态细胞悬液(如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下面的操作)，第一组，加入10 µl重组质粒DNA(体积不超过10µl) 100µl感受态细胞，此管为转化实验组。第二组，插入DNA片段对照组，即酶切后DNA片段25ng 100µl感受态细胞悬液；第三组，质粒DNA对照组，即1ng 未酶切pBluescript 质粒DNA十100µl感受态细胞悬液。

(2) 将以上各样品轻轻摇匀，冰上放置20-30min，于42℃水浴中保温1－2min，然后迅速冰上冷却2min

(3) 立即向上述管中分别加入0.4ml LB液体培养基（不需在冰上操作），使总体积到0.5ml，该溶液称为转化反应原液，摇匀后于37℃振荡培养约45-60min ，使受体菌恢复正常生长状态，并使转化体表达抗生素基因产物(Ampr)。

3) 平板培养（有时需要稀释）

(1) 取各样品培养液0.1ml，分别接种于含抗菌素LB平板培养基上，涂匀（如果用玻璃棒涂抹，酒精灯烧过后稍微凉一下再用，不要过烫）。

(2) 菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，于37℃恒温培养箱内培养过夜(12-16小时)，待菌落生长良好而又未互相重叠时停止培养，对于可以蓝白斑筛选的质粒和菌株来说，此时应该能清楚地看到蓝色和白色菌落。

用 CaCl2法制备的感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA产生5×106-2×107个转化菌落。在实际工作中，每微克有105以上的转化菌落足以满足一般的克隆实验。

4) 检出转化体和计算转化率

各实验组在培养皿内菌落生长状况及结果分析

转化体总数＝菌落数×（转化反应原液总体积/涂板菌液体积）

插入频率＝蓝色菌落数/白色菌落数

转化频率＝转化体总数/加入质粒DNA的量（计算出每微克的转化菌落数）