聚丙烯酰胺凝胶电泳法（PAGE）分离血清蛋白质（核黄素-TEMED聚合系统）（图）
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一、目的：
1．学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
2．掌握聚丙烯酰胺园盘电泳的操作技术。
3．比较醋酸纤维薄膜电泳与本法分离血清蛋白质的效果。
二、原理：
（一）盘状电泳原理
盘状电泳是在区带电泳原理的基础上，以孔径大小不同的聚丙烯酰胺凝胶作为支持物，采用电泳基质的不连续体系（即凝胶层的不连续性、缓冲液离子成分的不连续性、pH的不连续性及电位梯度的不连续性），使样品在不连续的两相间积聚浓缩成很薄的起始区带（厚度为10-2厘米），然后再进行电泳分离。
盘状电泳名称来源即由于此法的原理是依靠基质不连续性（discontinuity），凑巧分离出的区带也很象圆盘状（discoid shape），取“不连续性”及“圆盘状”的英文字头“disc”。因此，英文名称为disc electrophoresis，中文直译为盘状电泳。
仪器装置：（见图15-1）。上下两个槽为圆形或方形，其中注入缓冲液。上下槽的缓冲液中分别有正、负电极通入。上槽底部有很多小孔，可插入装有聚丙烯酰胺凝胶的玻璃管。
这里仅以Davis和Orstein（1964）用分析血清蛋白的高pH的不连续系统为便说明其基本原理。此系统是一个高pH的碱性系统，或称阴离子系统，最初用于分析血清蛋白，但也适用于其他的酸性和中性蛋白。很多细胞蛋白质，或病毒的结构蛋白在此系统中（pH8～9）解离成阴离子，向阳极移动。系统由下列三种不连续的凝胶组成。即在每支玻璃管中装有三层不同的凝胶（见图15-2）。最上层为样品胶，中层为浓缩胶（又称间隔胶或积层胶），下层为分离胶（又称电泳胶）。
在盘状电泳过程中有三种物理效应：①样品的浓缩效应，②凝胶的分子筛效应，③一般电泳分离的电荷效应。由于这三种物理效应,使样品分离效果好，分辨率高。例如人血清用纸电泳（PH8.6）可以分成5～7个成分，而用盘状电泳也可分成20～30个条带清晰的成分（参看图15-3）。若采用不连续的浓度梯度凝胶柱，则可增至62个条带。又如人的唾液经盘状电泳。可分出10多个蛋白质条带（参看图15-4）。
下面就盘状电泳过程中三种物理效应的原理加以说明。
1．样品的浓缩效应：由于电泳基质的四个不连续性，使样品在电泳开始时，得以浓缩，然后再被分离。
（1）凝胶层的不连续性：三层不同的凝胶，其作用如下：
样品胶：为大孔凝胶，用光聚合法制备，样品预先加在其中再聚合起防止对流的作用，避免样品跑到上面的缓冲液中。
浓缩胶：为大孔凝胶，用光聚合法制备，有防对流作用。样品在其中浓缩，并按其迁移率递减的顺序逐渐在其与分离胶的界面上积聚成薄层。
分离胶：为小孔胶，一般采用化学聚合法制备。样品在其中进行电泳和分子筛分离。也有防对流作用。
蛋白质分子在大孔凝胶中受到的阻力小，移动速度快。进入小孔凝胶时遇到的阻力大，速度就减慢了。由于凝胶层的不连续性，在大孔与小孔凝胶的界面处就会使样品浓缩，区带变窄。
（2）缓冲液离子成分的不连续性
在电场中如有两种电荷符号相同的离子向同一方面泳动，其迁移率不同，两种离子若能形成界面，则走在前面的离子称为快离子（又称先行离子），走在后面的离子称为慢离子（又称随后离子）。为使样品达到浓缩的目的，需在电泳缓冲系统中加入有效迁移率大小不相同的两种离子。并使这两种离子在缓冲系统中组成不连续的两相。即在三层凝胶中加入快离子，在电极缓冲液中加入慢离子。
为了保持溶液的电中性及一定的pH，需加入一种与快、慢离子符号相反的离子，称为缓冲配对离子。使缓冲配对离子分布于全部电泳缓冲系统中（即三层凝胶及电极缓冲液中）。例如分离蛋白质样品时，通常用Cl-为快离子，NH2CH2COO-为慢离子，采用三羟甲基氨基甲烷（简称Tris）作为缓冲配对离子。
电泳开始前，如图15-5A所示，慢离子位于两个电极槽中，快离子分布在三层凝胶中，样品在样品凝胶中，缓冲配对离子位于全部系统中。电泳进行中如图15-5B所示，快离子与慢离子的界面向下移动，由于选择适当的pH缓冲液，使蛋白质样品的有效迁移率（有效迁移率=mα，m为迁移率，α为解离度）介于快离子与慢离子的界面处，而浓缩成为极窄的区带。它们的有效迁移率按下列次序排列：mclαcl＞mpαp＞mGαG（Cl代表氯离子，P代表蛋白质，G代表甘氨酸负离子）。样品若是有颜色的，可以看到样品在界面处浓缩成极窄的区带。样品的分离，如图15-5C所示。当样品达到浓缩胶与分离胶界面处，离子界面继续前进，蛋白质被留在后面，然后分成多个区带。
3）电位梯度的不连续性
电位梯度的高低与电泳速度的快慢有关，因为电泳速度等于电位梯度与迁移率的乘积。迁移率低的离子，在高电位梯度中可以与具有高迁移率而处于低电位梯度的离子具有相似的速度。在不连续系统中，电位梯度差异是自动形成的。电泳开始后，由于快离子的迁移率最大，就会很快超过蛋白质，因此在快离子的后边形成一个离子浓度低的区域即低电导区。
电导与电位梯度是成反比的：
式中E为电位梯度，I为电流强度，η为电导率。
所以低电导区就有了较高的电位梯度。这种高电位梯度使蛋白质和慢离子在快离子后面加速移动。
当快离子、慢离子和蛋白质迁移率和电位梯度的乘积彼此相等时，则三种离子移动速度相同。
在快离子和慢离子的移动速度相等的稳定状态建立之后，则在快离子和慢离子之间形成一个稳定而又不断向阳极移动的界面。也就是说在高电位梯度区和低电位梯度区之间的地方形成一个迅速移动的界面（图15-6）。由于蛋白质样品的有效迁移率恰好介于快、慢离子之间，因此也就聚集在这个移动的界面附近，被浓缩形成一个狭小的中间层。
4）pH的不连续性
在浓缩胶与分离胶之间有pH的不连续性，这是为了控制慢离子的解离度，从而控制其有效迁移率。要求在样品胶和浓缩胶中，慢离子较所有被分离样品的有效迁移率低，以使样品夹在快、慢离子界面之间，使样品浓缩。而在分离胶中慢离子的有效迁移率比所有样品的有效迁移率高，使样品不再受离子界面的影响。
①浓缩胶应有的pH值
②分离胶应有的pH值
在分离胶中要求甘氨酸有效迁移率（mGαG）超过所有的蛋白质的有效迁移率。这样甘氨酸的泳动速度即超过所有蛋白质，使分离胶保持均一的pH及电位梯度，以便蛋白质样品在其中进行普通的电泳分离和分子筛分离（如图15-5C所示）。
血清中的前清蛋白在7.5%凝胶中的迁移率小于-0.5单位，则mGαG至少应为-5.0。即α= 1/3，按上述计算pH应为9.5。实际上Davis所用的配方中，分离胶的pH值为8.9。但在电泳分离时，根据实际测定证明与理论计算相符，实际上比原制备时的pH约高出半个pH单位，所以与要求的数值是符合的。
2．分子筛效应
分子量或分子大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径的分离胶时，受阻滞的程度不同，因此表现出不同的迁移率，即所谓分子筛效应。即使净电荷相似，也就是说自由迁移率相等的蛋白质分子，也会由于分子筛效应在分离胶中被分开。
此处分子筛效应是指样品通过一定孔径的凝胶时，小分子走在前面，大分子走在后面。而在柱层析方法中的分子筛作用，则是大分子通过凝胶颗粒之间的缝隙先流出，而小分子则通过凝胶颗粒内的孔道后流出。
3．电荷效应
蛋白质混合物在凝胶界面处被高度浓缩，堆积成层，形成一狭小的高浓度的蛋白质区，但由于每种蛋白质分子所载有效电荷不同，因而迁移率不同。承载有效电荷多的，泳动的快，反之则慢。因此各种蛋白质就以一定的顺序排列成一个一个的圆盘状。在进入分离胶中时，此种电荷效应仍起作用。
（二）聚丙烯酰胺凝胶的性能及制备原理
1．性能
聚丙烯酰胺凝胶的机械强度好，有弹性，透明，相对地化学稳定，对pH和温度变化较稳定，在很多溶剂中不溶，是非离子型的，没有吸附和电渗作用。原料成分要采用高纯度制品，通过改变浓度和交联度，可以控制孔径变动在极广泛的范围，并且制备凝胶的重复性好，由于纯度高及不溶性，因此还适于少量样品的制备，不致污染样品。
2．制备原理
聚丙烯酰胺是用丙烯酰胺（acrylamide，简称Acr）和交联剂甲叉双丙烯酰胺（N，N，N＇，N＇-methylene bisacrylamide，简称Bis）在催化剂的作用下聚合而成。它们的结构式见下页。
聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种：
（1）化学聚合：化学聚合的催化剂通常多采用过硫酸铵（ammonium persulfate，简称AP）或过硫酸钾，此外还需要一种脂肪族叔胺作为加速剂，最有效的加速剂为N，N，N＇，N＇-四甲基乙二胺（N，N，N＇，N＇-tetramethyl ethylenediamine，简称TEMED），其次为三乙醇胺及二甲氨基丙腈（3-dimethylaminopropionitrile，简称DMPN）。在叔胺的催化下，由过硫酸铵形成氧的自由基，后者又使单体形成自由基，从而引发聚合作用。叔胺要处于自由碱基状态下才有效。所以在低pH时，常会延迟聚合作用。分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用，一些金属离子也能抑制聚合。冷却可以使聚合速度变慢。通常控制这些因素使聚合在1小时内完成，以便使凝胶的性质稳定。
（2）光聚合：光聚合通常用核黄素为催化剂。不一定加TEMED即能聚合，但加入则可加速聚合。
光聚合通常需要有痕量氧存在，核黄素经光解形成无色基。后者被氧再氧化形成自由基，从而引发聚合作用。但过量的氧会阻止链长的增加，应该避免过量的氧存在。
光聚合通常用日光灯或普通钨丝灯泡作光源，直接日光或室内强散射光也可以。
用核黄素进行光聚合的优点是：①核黄素的用量很低（1毫克/100毫升）；②通过光照可以预定聚合时间，但光聚合的凝胶孔径较大，而且随时间延长而逐渐变小，不太稳定，所以用它制备大孔凝胶较适合。化学聚合的凝胶孔径较大，因而采用过硫酸铵-TEMED催化系统制备小孔凝胶（分离胶），而且制备的重复性好。
3．凝胶浓度和交联度与孔径大小的关系
凝胶浓度与被分离物的分子量大小的关系，大致范围如表15-1。
聚丙烯酸胺：
常用的所谓标准凝胶是指浓度为7.5%的凝胶，大多数生物体内的蛋白质在此凝胶中电泳能得到满意的结果。当分析一个未知样品时，常常先用7.5%的标准凝胶或用4～10%的凝胶梯度来试测，而后选出适宜的凝胶浓度。
凝胶的机械性能、弹性是否适中是很重要的，胶太软易于断裂，尤其在制作板型电泳的薄片状凝胶时，太软很难操作。太硬则脆，也易折断。凝胶的透明度、粘着度是否合适也影响分离效果。凝胶的机械性能、弹性、透明度和粘着度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis两者之比例。
凝胶密度或凝胶浓度，可以用二个字母T和C来定义。T代表丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺二个单体的总百分浓度。C代表总浓度T中交联剂Bis的百分浓度。Hjertern S.推导出如下这个式子，用以计算凝胶的用量。
这里
为丙烯酰胺的量（g）
b为亚甲基双丙烯酰胺的量（g）
m为缓冲液体积（ml）
a/b的值是有临界线的，如果a/b＜10，制成的凝胶脆而易碎，坚硬而不透明。如果a/b＞100，即使5%的丙烯酰胺也是糊状的，容易破碎。a/b的值接近30时（其中丙烯酰胺的量必须＞3%），可以制成既有弹性又完全透明的凝胶。
Davis B.J.在1964年，研究了丙烯酰胺和亚甲基双丙烯酰胺的浓度范围，分别为1.5～60%和0～0.626%之间的凝胶形成情况。他发现丙烯酰胺浓度＜2%，亚甲基双丙烯酰胺浓度＜0.5%，不发生聚合凝固作用。为了获得一种有弹性的凝胶，在增加丙烯酰胺浓度的同时，应适当减低亚甲基双丙烯酰胺的浓度。对于这个要求，Richards E.C.等人提出了如下一个经验公式：
C=6.5-0.3T
浓度在5～20%范围内，可以应用这个式子容易地计算凝胶的组成用量。式中C可有1%的变化。
对于人血清蛋白质的分离，Brackenridge C.J.等人，推导出了下面这个经验式，用以计算最适的凝胶浓度，以便获得最好的分辨率。
B=0.201-0.0112T
这里，B代表亚甲基双丙烯酰胺的百分浓度，T为二个单体总的百分浓度。
用于研究大分子核酸的凝胶多为大孔径凝胶，太软，不易操作，最好加入0.5%琼脂糖。有的在3%凝胶中加20%蔗糖，也可增加机械强度而又不影响孔径大小。
（三）几种染料的性能及染色原理
1．氨基黑10B（amino black 10B）
C22H13O12N6S3Na3
MW=715，λmax=620～630nm。氨基黑是酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐。是最常用的蛋白质染料。但用氨基黑染SDS-蛋白质时效果不好。另外，氨基黑染不同蛋白质时的着色度不等，色调不一（有蓝、黑、棕等），作同一凝胶柱的扫描时误差较大，需要对各种蛋白质作出本身的蛋白质-染料量（吸收值）的标准曲线。
2．考马斯亮蓝R250（Coomassie brilliant blue R250）。C45H44O7H3S2Na，MW=824， λmax=560～590nm。染色灵敏度比氨基黑高5倍。尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。但蛋白质浓度超出一定范围时，对高浓度蛋白的染色不符合Beer定律，用作定量分析时要注意这点。
3．考马斯亮蓝G250，又名Xylene brilliant cyaninG。比考马斯亮蓝R250多二个甲基。MW=854；λmax=590～610nm。染色灵敏度不如R250，但比氨基黑高3倍。优点在于它在三氯乙酸中不溶而成胶体，能选择地染色蛋白而几乎无本底色。所以常用于需要重复性好和稳定的染色，适于作定量分析。
4．1-苯胺基-8-萘磺酸（1-anilino-8-naphthalene sulfonic acid，简称ANS），本身无荧光，但与蛋白质结合后则产生荧光。电泳后，取出凝胶入在平皿中，用此染料溶液浸1～3分钟，用长波紫外灯照射时，产生黄色荧光。可显示蛋白质100微克，如果不明显，可将凝胶取出暴露于空气或盐酸气中，或浸没在3mol/L盐酸中几秒至2分钟，使表面蛋白质稍变性，然后再用ANS染色，这样可显示蛋白质20微克。
这样的染色优点是可保留凝胶内部的酶和抗体的活性。可将该区带切下来进行酶活力测定；也可直接把凝胶捣碎研细，用作抗原来注射动物，聚丙烯酰胺不影响抗体的产生。
聚丙烯酰胺盘状电泳具有使样品区带浓缩变窄的作用，所以分辨力高，在很多情况下超过超速离心和常用的层析及一般电泳技术；设备简单，样品量小（1～100微克）；时间短，操作方便，可分离物质的分子大小范围广泛，由多肽到核糖核蛋白体及病毒都可以分离，亦可改变为超微量测定（10-9～10-12克），并可结合SDS来测定蛋白质亚基分子量；或测定核酸等的分子量。这种方法现在几乎代替了超速离心沉降法。它还可以结合等电点聚焦电泳以提高分辨率。
聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳用途较广，对生物高分子化合物能进行分离、定性、定量分析，又能用于制备毫克水平的材料。
三、器材及试剂：
1．器材：
①血清以及其他蛋白质样品。
②圆盘电泳槽、稳压直流电源（500V）。
③玻璃管0.5×7～10cm（×1）及制胶架。
④日光灯。
⑤三角烧瓶。
⑥注射器10ml（×1）、长针头。
⑦滴管。
⑧培养皿￠10cm（×5）。
⑨吸管1ml（×1）、2ml（×1）、5ml（×1）、0.5ml（×1）。
⑩凝胶成像系统或光密度计。
2．试剂：
①丙烯酰胺（Acr）：分析纯。如不纯，可按下法重结晶：90g丙烯酰胺，溶于500ml50℃氯仿，热滤，滤液用盐冰浴降温，即有结晶析出。砂芯漏斗过滤，收集结晶。按同法再重结晶一次。结晶于室温中赶尽氯仿（约得50g左右，M.P84.3℃），贮棕色瓶中，干燥低温保存（4℃）。
②N，N＇-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）：分析纯。如不纯按下法处理：12g亚甲基双丙烯酰胺，溶于1000ml40～50℃丙酮。热滤，滤液慢慢冷至-20℃，结晶析出，砂芯漏斗吸滤，结晶用冷丙酮洗数次，真空干燥。贮棕色瓶，干燥低温（4℃）保存。
（注意：Acr和Bis都是神经毒剂，对皮肤有刺激作用，应在通风橱内操作。操作者需戴医用乳胶手套）
③N，N，N＇，N＇-四甲基乙二胺（简称TEMED）：密封保存。可用N-二甲基氨基丙腈或三乙醇胺代替，但效果较差。
④三羟甲基氨基甲烷（简称Tris）。
⑤核黄素：避光保存。光聚合催化剂。
⑥7%醋酸溶液（V/V）。
⑦0.5%氨基黑10B（C22H13O12N6S3Na3）溶液：用7%醋酸溶液配制。
⑧0.01%溴酚蓝溶液。
⑨蔗糖。
⑩PH8.4硼酸缓冲液（0.2mol/L硼酸盐）。
四、操作步骤：
1．贮备液的配制：按表15-2配制A、B、C、D、E、F各贮备液：
上述各贮备液都需冷藏（4℃）。尤其是C、D两贮液，由于Acr及Bis易水解生成丙烯酸和NH3，冷藏也只能保存1～2月。如PH超过5.2，即失效。
2．凝胶的制备：
（1）将内径0.5cm的玻管切成7～10cm长，切口磨光，洗液浸泡后，水洗净烘干。
（2）分离胶的制备及预电泳：于一小三角烧瓶内，按A∶C∶H2O∶E=1∶2∶4.6∶0.4（V/V）加入各贮液，摇匀，抽气（水泵或油泵）10分钟，将此胶液装入玻管2/3高度（玻管直立，下端插入制胶架凹横内凹槽内事先加入F液1～2滴）。表面覆盖少量蒸馏水，以隔绝空气并使胶面平整。用日光灯照射20分钟，刚加水覆盖时，可看出界面，后界面逐渐消失，聚合完成后，界面又重新出现，再静置30分钟使聚合完成。胶液凝聚后，用小滤纸条，小心吸去表面水分。
分离胶的预电泳（此步操作根据实验的需要决定取舍）：凝胶聚合程度一般在90%以上。残留的物质，尤其是过硫酸铵，对某些样品（如酶）会造成钝化或引起其它人为效应。因此有时需要在正式电泳前，先用电泳方法除去这些残留物，这步称为“预电泳”。若直接用光密度计来扫描分离的区带，则预电泳步骤更为必要，因未聚合的丙烯酰胺单体对紫外光有较高吸收，会干扰测定。
预电泳步骤：小心地拔出玻璃管，用滤纸吸干（不要直接接触胶面）后，用分离胶缓冲液（即不含TEMED的A液）洗涤一下。把玻璃管插入电泳装置中，塞紧橡皮塞上下电极槽中加入分离胶缓冲液，玻璃管下端不得有气泡，预电泳用3毫安/管，30分钟～2小时。
预电泳不能在制好浓缩胶后进行，也不能用电极缓冲液进行，不然会破坏不连续系统，而使浓缩效应失效。如不用预电泳也可采用加1—5%巯基乙醇或二巯基苏糖醇到缓冲液和样品中来抵消过硫酸铵的氧化作用。
预电泳后，凝胶管含少量缓冲液，并用液体石腊封住，在4℃可贮藏几天。取用时，用注射器吸去液体石腊。
（3）浓缩胶（又称成层胶）的制备：于一小三角烧瓶内按B∶D∶E∶H2O=1∶2∶0.5∶4.5（V/V）比例加入各贮液，混合后，抽气，加到玻管中分离胶的上面，高度约1cm，表面覆盖一层水，然后距日光灯10cm处进行光照，正常情况下，照射几分钟后，则凝胶液由淡黄色变成乳白色，表明聚合开始，继续照射30分钟，使聚合完全。凝聚后吸去表面水分。浓缩胶层应临用前制备。
3．样品的准备
聚丙烯酰胺盘状电泳可用以分离各种蛋白质、核酸等样品。例如血清（参看图15-3）、唾液（参看图15-4）、细胞膜蛋白、动植物及微生物的各种蛋白提取液、昆虫的体液、各种酶制品及核糖核酸等。初学者可采用血清样品练习操作。
盘状电泳所需要的样品是很少的。一个标准凝胶管按体积需要5～100微升的样品（约0.1～2毫米高）；按含量需要5～100微克。实际上就是用1毫克/毫升浓度的样品5～100微升。由于样品组分的不同，用量可有一定的幅度。对于只含有少数组分的样品，可用到10～20微克；对于含有多种组分的样品，可用到200微克。即每一凝胶柱的样品容纳量不仅指所加的样品总量，更重要的是指样品混合物中各组分的量。所加样品液量的精确性将影响重复性，误差要不大于±5%。
近来，样品胶一般已改用样品液中加入5～20%蔗糖或10%甘油代替，因为这样品胶的作用主要是抗对流，蔗糖液和甘油能起同样的效果。
如果样品离子强度太高，会引起分离界面模糊不清，严重时完全不能进行电泳。因离子强度太高时降低了蛋白质的电动电位，同时电导过高，在样品部分几乎没有电位梯度，以至样品的泳动速度近于零，不能泳动。硫酸铵盐析的样品或柱层析高盐浓度的洗脱部分，必须透析除盐，务必使电导低于分离胶的电导，以便形成足够的电位梯度，使区带在分离之前进行浓缩变窄。
如果样品过稀，加样体积太大时，相应地加厚浓缩胶层。玻璃管也要加长。一般采用稀样品液与浓缩胶之比为1∶1.2。
一个生物样品（粗抽提物），常需要事先经过处理（高速离心、微孔滤膜过滤、柱分离等），去除沉淀，消除混浊。或只取可溶性部分进行电泳。不然常有许多物质留在凝胶与缓冲液的界面上，会阻塞凝胶，干扰分离。当样品装载量与样品溶解度不相应时，也会在浓缩胶面上或浓缩胶与分离胶界面上产生沉淀，并造成拖尾现象（随着电泳过程，沉淀逐渐溶解、逐渐进入）。
指示染料是做为电泳时迁移的可见标志。对于碱性缓冲系统，一般用溴酚蓝或酚红（通常每管加0.005毫升0.1%的染料溶液）。对于酸性缓冲液系统，一般用甲基绿或次甲基蓝。指示染料可直接加在玻璃中或上电极槽的缓冲液中，也可与样品液混合。
本实验样品液准备：取血清、F液、0.01%溴酚蓝指示剂各0.1ml，放入一干净的小试管中混匀，待用。此为样品液。
4．安装凝胶管
加样前可先把凝胶管从制胶架上拔出，用少量硼酸缓冲液轻轻冲洗凝胶管底部凝胶，洗去底部F液，再充满缓冲液（不得有气泡），然后把凝胶管逐一安装在电泳槽上槽的圆孔中（要防止漏水，否则上槽缓冲液会漏入下槽，这是不允许的。）并使凝胶管下端插入下槽的硼酸缓冲液中。
5．加样品液
将上槽充以缓冲液，缓冲液面应高于玻管上口0.5cm以上。用微量注射器吸取前述准备好样品液15ml，缓缓加入各管凝胶表面，平铺一薄层。
6．电泳
检查装置无误后，连接直流稳压电源，负极在上，正极在下，打开电源开关，调节电流，开始时用1～2毫安/管，电泳1～2分钟，再逐渐升高电流到约3～5毫安/管，不要一开始就电流很高。电流最好不要超过3—5毫安/管，一般情况下，维护4毫安/管。太高的电流强度会造成产热量大。如果高温对样品不利，可降低电流，延长时间，或进行有效的冷却，缓冲液预冷至4℃，并在冷室进行电泳，或将凝胶管装有分离胶的一段完全浸没在下槽缓冲液中，利于散热。
电泳开始后，样品液应在5～10分钟内进入凝胶。指示染料进入缓慢，也是盐浓度（离子强度）太高的有力指示。
电泳过程中，一般要求电流保持稳定，这时可见电压升高。电泳时间与所用缓冲液和样品有关，一般可根据指示染料的迁移来决定，如指示染料已迁移到凝胶柱的下口附近，或已迁移管长的3/4距离时，就可停止电泳，关闭电源，倒出缓冲液后取出玻璃管。
缓冲液可再行使用，但应注意上下槽缓冲液不能混合或互换，因下槽中混入了催化剂及氯离子。如将下槽的缓冲液用于上槽，则影响电泳。
7．取出凝胶
用一长针头的注射器（针头长约10厘米），吸满水，将针头插入凝胶与管壁之间，慢慢旋转玻璃管，推针前进，同时注入水，靠水流压力和润滑作用将玻璃管内壁与凝胶分开，凝胶即可流出。一次不行，可由另一端同样操作即可。如凝胶浓度较高，取出困难，可用10%甘油水溶液代替水注入。一般剥胶方向是从浓缩胶端开始。剥胶时注意不要损伤凝胶柱表面。
8．固定
为防止凝胶柱内已分离成分的扩散，需要进行固定。只要把剥出的凝胶条浸泡在7%乙酸或12.5%三氯乙酸的水溶液中几分钟即可；或浸泡在用7%乙酸或12.5%三氯乙酸配制的染色液中，同时进行固定和染色。本实中的固定与染色同时进行。
9．染色：蛋白质的染色方法表15-3。
表15-3 蛋白质的染色法
本实用0.5%氨基黑10B的乙酸液（7%乙酸）染色2h。
10．脱色及保存
氨基黑染色后的凝胶用水冲洗掉表面染料，放在7%乙酸中浸洗，经常更换新溶液，直到染料不再洗出，背景几乎无色为止，约需2—3天。
脱色后的凝胶放在7%乙酸中，可以长期保存。
五、结果分析
用凝胶成像系统或光密度计扫描进行各电泳区带的定量分析。
