PI3K/Akt/mTOR信号通路

目的：通过特异性阻断PI3K和mTOR，观察HepG2和Hep3B细胞株PI3K/Akt/mTOR信号通路活性及生物学行为的改变，探讨相关的分子机制。

方法：在培养的HepG2、Hep3B人肝癌细胞株和人正常肝细胞株QSG-7701上，以免疫印迹方法（Western blot）检测各细胞株中PI3K（p110α亚单位）、PTEN、pAkt（S473，T308）和p-mTOR（S2448）的表达情况；分别用 PI3K抑制剂LY294002（50μmol/ml）和mTOR抑制剂Rapamycin（RAPA，50 nmol/ml）孵育HepG2和Hep3B细胞，以MTT比色法检测细胞的增殖能力，以流式细胞术（Flow cytometry）检测细胞周期和凋亡情况，以Western blot法检测细胞中pAkt（S473，T308）和p-mTOR（S2448）的表达改变。

结果：PTEN在HepG2和Hep3B细胞中基本无表达，在QSG-7701细胞株中高表达，pAkt和p-mTOR在HepG2和Hep3B细胞中的 表达较QSG-7701细胞均显著升高；LY294002和RAPA均呈剂量-时间依赖的抑制HepG2和Hep3B细胞生长。饱和效应浓度的 LY294002和RAPA作用24小时后，HepG2和Hep3B细胞均呈现明显的G0/G1期阻滞，处于S期的细胞比例较对照组显著减少 （P<0.01）；两给药组中HepG2细胞和Hep3B细胞的凋亡率与对照组比较均显著增加（P<0.01）；两给药组HepG2细胞的凋 亡率显著高于Hep3B细胞（P<0.01或P<0.05），并且HepG2细胞的凋亡率在RAPA给药组显著高于LY294002给药组 （P<0.01），但Hep3B细胞的凋亡率在两组间无显著差异。饱和效应浓度的LY294002作用48小时后，HepG2和Hep3B细胞中 pAkt（T308，S473）和p-mTOR（S2448）的表达水平较对照组均显著降低（P<0.01），饱和效应浓度的RAPA作用48小时 后，HepG2和Hep3B细胞中P-mTOR（S2448）的表达水平较对照组均显著降低（P<0.01），而pAkt（T308，S473）的 表达水平较对照组均显著升高（分别P<0.01）。

目的：观察阿霉素（Doxorubicin，DOX）单用或与RAPA联合用药对HepG2和Hep3B细胞生物学行为及PI3K/Akt/mTOR信号通路活性的影响，探讨mTOR抑制剂增强HCC化疗药物疗效的相关作用机制。

方法：分别取对数生长期的HepG2和Hep3B细胞，以不同浓度的DOX单用或与RAPA（20 nmol/ml）联合应用培养48h或24h，以MTT法测定药物对HepG2和Hep3B细胞的增殖抑制作用，以流式细胞技术检测二者的凋亡情况，以 Western blot法检测者P-p70S6K（T389）、P-4E-BP1（S65）和pS6（S235/236）的表达改变。

结果：0.156～2.5 mg/L浓度范围内，DOX能抑制HepG2和Hep3B细胞的增殖，且呈浓度依赖性；DOX在0.625～10mg/L浓度范围内，Hep3B细胞的相 对存活率显著大于HepG2细胞（P<0.01）；与DOX单用比较，DOX（0.156～2.5mg/L）与RAPA联用显著降低了HepG2和 Hep3B细胞的存活率（P<0.01或P<0.05），DOX（0.156～10mg/L）与RAPA联用，Hep3B细胞存活率显著大于 HepG2细胞（P<0.01）。DOX（0.156～10mg/L）单用或与RAPA联用24h均可诱导HepG2和Hep3B细胞凋亡发生，且 随DOX浓度增加，凋亡牢升高；与DOX单用比较，DOX（1.25～10mg/L）与RAPA联用，HepG2细胞捌亡率较显著升高 （P<0.01或P<0.05），DOX（2.5～10 mg/L）与RAPA联用，Hep3B细胞凋亡率显著升高（分别P<0.05）；DOX（5.0～10mg/L）单用，HepG2细胞凋亡率显著大 于Hep3B细胞（分别P<0.05），DOX（2.5～10 mg/L）与RAPA联用，HepG2细胞凋亡率显著大于Hep3B细胞（分别P<0.01）。RAPA（20nmol/L）、DOX（2.5mg /L）以及二者联用均可导致HepG2或Hep3B细胞P-p70S6K（T389）、P-4E-BP1（S65）和pS6（S235/236）表达减 少，且以DOX与RAPA联用效应最为明显。

目的：分析人HCC组织中PI3K/Akt/mTOR信号通路的活化水平与p53的表达及HCC临床病理参数之间的关系，评估PI3K/Akt/mTOR信号通路在HCC诊断和预后评价中的作用。

方法：76例HCC组织样本经临床病理分期分级后，以免疫组织化学方法检测HCC组织和癌旁组织中p53、pAkt、PTEN、p-mTOR和pS6的表达情况，分析上述指标在不同HCC病理特征条件下的阳性表达率，并与正常肝组织比较。

结果：p53、pAkt、PTEN、p-mTOR和pS6在人HCC组织有不同程度的表达，HCC组织p53（60.5％，46/76）、 pAkt（92.1％，70/76）、p-mTOR（84.2％，64/76）和pS6（88.2％，67/76）的阳性表达比例较癌旁肝组织（分别为 10.5％，8/76、63.2％，48/76、46.1％，35/76、52.6％，40/76）和正常肝组织（分别为0％、55.0％，11/20、 50.0％，10/20、45.0％，9/20）显著升高（P<0.01），而PTEN（65.8％，50/76）的阳性表达比例较癌旁肝组织 （89.5％，68/76）和正常肝组织（85.0％，17/20）显著减少（P<0.05）；p53阳性表达HCC组织pAkt、p-mTOR和 pS6的阳性表达率较p53阴性表达组织显著升高（P<0.01），而PTEN的阳性表达率较p53阴性表达组织显著降低（P＜0.01）。低分 化、存在血管侵袭、TNM分期高的HCC组织p53、pAkt、p-mTOR和pS6的阳性表达率较相对应的分化较好、无血管侵袭、TNM分期低的HCC 组织显著升高（分别P<0.01或P<0.05）；而PTEN的阳性表达率显著降低（分别P<0.01或P<0.05）。