Northern Blot原理及实验方法

原理：在变性条件下将待检的RNA样品进行琼脂糖凝胶电泳，继而按照同Southern Blot相同的原理进行转膜和用探针进行杂交检测。

用途：检测样品中是否含有基因的转录产物（mRNA）及其含量。

实验方法：

[仪器、试剂、材料]

（一）仪器

恒温水浴箱，电泳仪，凝胶成像系统，真空转移仪，真空泵，UV 交联仪，杂交炉，恒温摇床，脱色摇床，漩涡振荡器，分光光度计，微量移液器，电炉（或微波炉），离心管，烧杯，量筒，三角瓶，等。

（二）材料

总RNA样品或mRNA样品，探针模板DNA(25 ng)，尼龙膜

（三）试剂

NorthernMax Kit（Cat. # 1940，Ambion, Inc.），琼脂糖，DEPC, X光底片，底片暗盒，Random Primer， dNTP Mixture，111 TBq/mmol[a-32P]dCTP，Exo-free Klenow Fragment和10 X Buffer, Sephadex G-50,SDS，双氧水, 灭菌水等。

[方法与步骤]

1. 用具的准备：

180度烤器皿：三角锥瓶、量筒、镊子、刀片等4小时。

电泳槽：清洗梳子和电泳槽，并用双氧水浸泡过夜，用DEPC水冲洗，干燥备用。

处理DEPC水(2 L)备用。

2．用RNAZaP去除用具表面的RNase酶污染

用RNAZap擦洗梳子，电泳槽，刀片等，然后用DEPC水冲洗二次，去除RNAZap。

3．制胶：

1)． 称取0.36mg 琼脂糖加入三角锥瓶中，加入32.4mlDEPC水后，微波炉加热至琼脂糖完全熔解。60℃空气浴平衡溶液 (需加DEPC水补充蒸发的水分)

2)． 在通风厨中加入3.6ml的10＊Denaturing Gel buffer，轻轻振荡混匀。

注意尽量避免产生气泡。

3)． 将熔胶倒入制胶板中，插上梳子

如果胶溶液上存在气泡，可以用热的玻璃棒或其它方法去除，或将气泡推到胶的边缘。注：胶的厚度不能超过0.5cm。

4)．胶在室温下完全凝固后，将胶转移到电泳槽中，加入1x MOPS Gel Running buffer盖过胶面约1cm，小心拔出梳子。（配制250ml　1＊MOPS Gel Running buffer，在电泳过程中补充蒸发的buffer。）

5)．检查点样孔。

4. RNA样品的制备

在RNA样品中加入3倍体积的formaldehyde load dye和适当的EB（终浓度为10ug/ml）。混匀后，65℃空气浴15min。短暂低速离心后，立即放置于冰上5min。

5. 电泳：

1). 将RNA样品小心加到点样孔中。

2). 在5V/cm下跑胶（5ｘ14cm）。在电泳过程中，每隔30min短暂停止电泳，取出胶，混匀两极的电泳液后继续电泳。当胶中的溴纷蓝（500bp）接近胶的边缘时终止电泳。

3). 紫外灯下，检验电泳情况，并用尺子测量18S、28S、溴纷蓝到点样孔的距离。

注意不要让胶在紫外灯下曝光太长时间