总维生素C的测定—2，4—二硝基苯肼比色法

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一、实验目的

1.了解天然维生素C 的结构功能以及天然存在形式。

2.掌握测定总维生素C 的原理与方法。

二、实验原理

总抗坏血酸包括还原型Vc、脱氢型Vc 和二酮古龙糖酸。样品中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸，再与2，4 — 二硝基苯肼作用生成红色脎。脎在硫酸溶液中的含量与总抗坏血酸含量成正比，由此通过比色可对样品中总坏血酸进行定量。

三、仪器和试剂

仪器

恒温箱：37±0.5℃、可见—紫外分光光度计 、组织捣碎机。

试剂

本实验用水均为蒸馏水，试剂纯度均为分析纯。

1.4.5mol/L 硫酸：小心将250mL 硫酸(比重1.84)加入到700mL 水中，冷却后用水稀释至1000mL。

2.85%硫酸：小心将90mL 硫酸(比重1.84)加入到100mL 水中，搅拌均匀。

3.2% 2，4 —二硝基苯肼溶液：溶解2g2，4 — 二硝基苯肼于100mL 4.5mol/L 硫酸内，过滤。不用时存于冰箱内，每次用前必须过滤

4.2%草酸溶液：溶解20g 草酸(H2C2O4)于700mL 水中，再加水稀释至1000mL。

5.1%草酸溶液：稀释500mL 2%草酸溶液到1000mL。

6.1%硫脲溶液：溶解5g 硫脲于500mL 1%草酸溶液中。

7.2%硫脲溶液：溶解10g 硫脲于500mL 1%草酸溶液中。

8.1mol/L 盐酸：取100mL 盐酸，加入水中，并稀释至1200mL。

9.抗坏血酸标准溶液(1mg/mL)：溶解100mg 纯抗坏血酸于100mL 1%草酸中。

10.活性炭：将100g 活性炭加到750mL1mol/L 盐酸中，回流1～2h，过滤，用水洗数次，至滤液中无铁离子(Fe 3+ )为止，然后置于110℃烘箱中烘干。

检验铁离子方法：利用普鲁士蓝反应。将2%亚铁氰化钾与1%盐酸等量混合，将上述洗出滤液滴入，如有铁离子则产生蓝色沉淀。

四、操作步骤

(一)样品的制备

全部实验过程应避光。

1.浸提：
鲜样的制备：称100g 鲜样和100g 2%草酸溶液，倒入捣碎机中打成匀浆，取10～40g 匀浆(含1～2mg 抗坏血酸)倒入100mL 容量瓶中，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。
干样制备：称1～4g 干样(含1～2mg 抗坏血酸)放入乳钵内，加入1%草酸溶液磨成匀浆，倒入100mL容量瓶内，用1%草酸溶液稀释至刻度，混匀。

将浸提液过滤，滤液备用。不易过滤的样品可用离心机 沉淀后，倾出上清液，过滤，备用。

2.氧化处理：

取25mL 上述滤液，加入2g 活性炭，振摇1min，过滤，弃去最初数毫升滤液。取10mL 此氧化提取液，加入10mL 2%硫脲溶液，混匀。

3.呈色反应

于三个试管中各加入4mL 上述混有硫脲的氧化提取液。一个试管作为空白，在其余试管中加入1.0mL 2% 2，4 — 二硝基苯肼溶液，将所有试管放入37±0.5℃恒温箱或水浴中，保温3h。3h 后取出，除空白管外，将所有试管放入冰水中，空白管取出后使其冷到室温。然后加入1.0mL 2%2，4 — 二硝基苯肼溶液，在室温中放置10～15min 后放入冰水内。当试管放入冰水后，向每一试管中加入5mL 85%硫酸，滴加时间至少需要1min，需边加边摇动试管。硫酸滴加完毕，将试管自冰水中取出，在室温准确放置30min 显色。

4.比色

用1cm 比色杯，以空白液调零点，于500nm 波长测吸光值。

(二)标准曲线绘制

加2g 活性炭于50mL 标准溶液中，摇动1 min，过滤。取10mL 滤液放入500mL 容量瓶中，加5.0g硫脲，用1%草酸溶液稀释至刻度，抗坏血酸浓度20μg/mL。

取5，10，20，25，40，50，60稀释液，分别放入7个100mL 容量瓶中，用1%硫脲溶液稀释至刻度，使最后稀释液中抗坏血酸的浓度分别为1，2，4，5，8，10，12μg/mL。按样品测定步骤形成脎并比色。

以吸光值为纵坐标，以抗坏血酸浓度(μg/mL)为横坐标绘制标准曲线。

五、计算

式中： X—样品中总抗坏血酸含量，mg/100g；

c—由标准曲线查得或由回归方程算得”样品氧化液”中总抗坏血酸的浓度，μg/mL；

V—试样用1%草酸溶液定容的体积，mL；

F—样品氧化处理过程中的稀释倍数；

m—试样质量，g。

同一实验室平行或重复测定，相对偏差绝对值≤10%。