纯化心肌细胞差速贴壁的时间

大部分文献报导差速时间是2小时，但我个人做实验是遇到的情况说明2小时有些长了，已经有心肌细胞贴壁，而且把上层悬液吸出后转移，不知道为什么不好帖壁，成活率较低。我用的是0.125%胰酶分次消化。请各位有经验的战友讨论。

我觉得影响心肌细胞贴壁的因素可以总结为如下几点：

1、所用老鼠的品系以及年龄

SD大鼠和Wister大鼠还是有很大差别的，包括小鼠在内也是，大部分用SD大鼠差速贴壁时间为2小时，个人认为1.5小时也行，只是一个范围而已。有时由于买的是活力不好的的老鼠导致贴壁能力较差。

2、培养基的PH值

由于心肌细胞非常娇嫩，PH如果很碱的话就比较难贴壁。所以我们每次都是在取材之前才调培养基的PH值，这样避免ph值出现较大范围的波动（培养基配置一段时间后，如果hepes加的量不够，PH可能会变化较大）。

3、细胞接种密度

很多人为了省事，不喜欢计数，结果接种密度太大影响贴壁，密度太小，细胞之间不能形成有效得到联系（即分泌一些生长因子促进生长）

4、血清的问题

我们开始用四季青的，养的很好的后来换了批次就养的不好了。不是我崇洋媚外，国产的血清就是性能不稳定，即批次之间的稳定性比较差，现在我们用hyclone的效果一直不错，

5、培养瓶的问题

如果细胞的状态不佳，不妨预先用多聚赖氨酸或者明胶处理一番，经费允许的话，用血清预处理过夜也行，感觉即使是用玻璃的培养瓶经过处理以后贴壁得能力也不错，不过建议还是用coring的，griner（德国产）也行。

6、胰蛋白酶的问题

浓度与作用时间都是比较大的影响因素，值能耗靠自己摸索了，我们用0.25%取出来的心肌细胞总是长的不咋的，也许是水平有限吧。

这是最近一段时间养心肌细胞的小小经验，希望以后可以能和大家好好交流

我也是近期在培养心肌细胞，总体感觉贴壁的时间，我们现在就用1小时15分钟就足够了，贴壁完了，把上清吸出以后再用完全培养基洗一遍，可以把一些附着在成纤维细胞表明的心肌细胞洗下来，以保证细胞数。

我们觉得胰酶的消化力还是太强了，单用胰酶的话，建议把浓度调低一点，我们以前一直用0.08%的胰酶分次消化。现在改用胰酶加胶原酶，即0.125%胰酶+0.08%胶原酶等比混合后消化10分钟，一般10只老鼠我们用混合酶10ml第一次消化，后面根据剩余的组织量调整消化酶的体积，一般要求吹打后能将组织充分在消化酶中分散开，即传统所说的组织量的30-50倍。这种方法我们经常消化2-3次就完全可以了。

大家说的很好，关于PH值、血清的选择、还有板都很重要，有条件的话尽量选择国外的产品。还有心肌细胞培养不用包板也能贴壁得很好的，你们可以再试试。

还有一点就是各种培养板上所种的细胞密度一定要合适，现将我们所用的写在下面仅供参考：T25培养瓶：5×106，最多可装7ml；6孔板：2.5×106，2ml；24孔板：2.5×105，1ml；96孔板：5×104，100ul。

你们差速时是放在进口一次性的瓶子里吗？我用的都是coring的，都是新的，现在我们实验室都还没有专门去处理用过的这些瓶子，所以我们都是一次性使用，为了节约我开始都是放在玻璃瓶中，差速后才转移到一次性瓶子中的。请问用玻璃瓶差速1小时15分够吗？差速完是不是看到成纤维细胞已经贴壁而且有细胞形态了呢？

我培养原代心肌细胞采用的是0.1%胰酶+0.05%胶原酶II，用D-hanks或PBS配制消化心肌组织。差速贴壁2h， 用一次性原代培养瓶即可。