SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定蛋白质的分子量（垂直板型电泳）

一、目的：

1．学习SDS—PAGE测定蛋白质分子量的基本原理。

2．掌握垂直板型电泳的基本操作技术。

二、原理：

由实验十五中已知，蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。

1967年，Shapiro等人发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入阴离子去污剂十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfate，简称SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量，而与所带电荷和形状无关。在一定条件下，蛋白质的分子量与电泳迁移率间的关系，可用下式表示：

因此，测定某个蛋白质的分子量，只需比较它和一系列已知分子量的蛋白质在SDS-凝胶电泳时的迁移率就可以了。后来，Weber等人基本按Shapiro的方法对约40种蛋白质进行了研究，进一步证实了这个方法地可行性。用这种方法测定蛋白质的分子量，简便、快速，只需要廉价的设备和微克量的蛋白质样品；所得结果，在分子量为15,000—200，000的范围内，与用其他方法测得的分子量相比，误差一般在±10%以内。因此，近几年来，SDS-凝胶电泳测定分子量的方法，已得到非常广泛的应用和迅速的发展。

为了阐明SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量的原理，许多人进行了深入的研究。实验证明，在蛋白质溶液中加入SDS和巯基乙醇后，巯基乙醇能使蛋白质分子中的二硫键还原；SDS能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上，形成蛋白质-SDS复合物。在一定条件下，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4克SDS/1克蛋白质。由于十二烷基磺酸根带负电，使各种蛋白质的SDS-复合物都带上相同密度的负电荷，它的量大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，因而掩盖了不同种类蛋白质间原有的电荷差别。

SDS与蛋白质结合后，还引起了蛋白质构象的改变。蛋白质-SDS复合物的流体力学和光学性质表明，它们在水溶液中的形状，近似于雪匣烟形的长椭圆棒，不同蛋白质的SDS复合物的短轴长度都一样，约为18A，而长轴则随蛋白质的分子量成正比地变化。

这样的蛋白质-SDS复合物，在凝胶电泳中的迁移率，不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而只是椭圆棒的长度也就是蛋白质分子量的函数。

将蛋白质-SDS复合物在不同浓度的SDS-凝胶中电泳，得到的结果按Ferguson公式作图，也证明了蛋白质-SDS复合物的上述性质。

Ferguson公式：1gmR=1gm0—KRC

该公式原来是Ferguson提出来描述蛋白质在淀粉凝胶中电泳行为的，后来证明它也同样适用于聚丙烯酰胺凝胶电泳，式中mR是蛋白质在一定浓度凝胶（C）中的迁移率；m0是当凝胶浓度外推到零时的迁移率即自由迁移率，它与蛋白质的净电荷量（q）成正比，与蛋白质在溶液中的摩擦系数（f）成反比（m0∝q/f，f由溶液的粘滞性、蛋白质分子的大小和形状决定）；KR是阻滞系数（retardation coefficient），它与蛋白质分子量成线性关系。因此，不同的蛋白质分子有不同的mR，m0和KR值，几种蛋白质的Ferguson。

而蛋白质-SDS复合物的Ferguson图则不同。

不同蛋白质的SDS复合物的m0值都很接近，分子量相差5倍的蛋白质之间，m0值只相差10%，如果忽略这个差别，就可以认为，各种蛋白质-SDS复合物的m0基本上是一个定值。这表明，不同蛋白质的SDS复合物都带有相同密度的负电荷，并具有同样的构象，因此，它们的净电荷量与磨擦系数之比（q/f）都接近于一个定值而不受各种蛋白质原来的电荷、分子大小和形状的影响，因而，在溶液中，自由迁移率就表现出一致性；但在一定浓度的凝胶中，由于引入了凝胶的分子筛效应，电泳迁移率mR就成为蛋白质分子量的函数。

根据以上事实，可以认为SDS-凝胶电泳测定蛋白质分子量方法的基础是可靠的。当然，还有许多问题有待于更深入地研究。

在用SDS-凝胶电泳法测定蛋白质分子量时，应注意以下几个问题：

1．如果蛋白质-SDS复合物不能达到1.4克SDS/1克蛋白质的比率并具有相同的构象，就不能得到准确的结果。影响蛋白质和SDS结合的因素主要有以下3个：（1）二硫键是否完全被还原：只有在蛋白质分子内的二硫键被彻底还原的情况下，SDS才能定量地结合到蛋白质分子上去，并使之具有相同的构象。一般以巯基乙醇作还原剂。在有些情况下，还需进一步将形成的巯基烷基化，以免在电泳过程中重新氧化而形成蛋白质聚合体。（2）溶液中SDS的浓度：溶液中的SDS的总量，至少要比蛋白质的量高3倍，一般需高达10倍以上。（3）溶液的离子强度：溶液的离子强度应较低，最高不能超过0.26，因为SDS在水溶液中是以单体和分子团的混合体而存在的，SDS结合到蛋白质分子上的量，仅决定于平衡时SDS单体的浓度而不是总浓度，在低离子强度的溶液中，SDS单体具有较高的平衡浓度。

2．不同的凝胶浓度适用地不同的分子量范围，Weber的实验指出，在5%的凝胶中，分子量25,000—200,000的蛋白质，其分子量的对数与迁移率呈直线关系；在10%的凝胶中，10.000—70,000分子量的蛋白质呈直线关系；在15%的凝胶中，10,000—50,000分子量的蛋白质呈直线关系；3.33%（以上各种浓度的凝胶，其交联度都是2.6%）的凝胶可用于分子量更高的蛋白质。

可根据所测分子量范围选择最适凝胶浓度，并尽量选择分子量范围和性质与待测样品相近的蛋白质作标准蛋白质。标准蛋白质的相对迁移率（蛋白质的电泳迁移距离除以染料迁移距离即为相对迁移率，详见后）最好在0.2—0.8之间均匀分布。

在凝胶电泳中，影响迁移率的因素较多，而在制胶和电泳过程中，很难每次都将各项条件控制得完全一致，因此，用SDS-凝胶电泳法测定分子量，每次测定样品必须同时做标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。

3．有许多蛋白质，是由亚基（如血红蛋白）或两条以上肽链（如α-胰凝乳蛋白酶）组成的，它们在SDS和巯基乙醇的作用下，解离成亚基或单条肽链。因此，对于这一类蛋白质，SDS-凝胶电泳测定的只是它们的亚基或单条肽链的分子量，而不是完整分子的分子量。为了得到更全面的资料，还必须用其它方法测定其分子量及分子中肽链的数目等，与SDS-凝胶电泳的结果互相参照。

4．不是所有的蛋白质都能用SDS-凝胶电泳法测定其分子量，已发现有些蛋白质用这种方法测出的分子量是不可靠的。这些蛋白质有：电荷异常或构象异常的蛋白质，带有较大辅基的蛋白质（如某些糖蛋白）以及一些结构蛋白如胶原蛋白等。例如组蛋白F1，它本身带有大量正电荷，因此，尽管结合了正常比例的SDS，仍不能完全掩盖其原有正电荷的影响，它的分子量是21,000，但SDS-凝胶电泳测定的结果却是35,000。因此，在分析SDS-凝胶电泳所得的结果时，应该小心。

一般至少用两种方法来测定未知样品的分子量，互相验证。为了判断待测样品是否可用SDS-凝胶电泳法来测定分子量，也可以使蛋白质-SDS复合物在不同浓度（交联度相同）的SDS-凝胶中电泳，得到Ferguson图。如果待测样品的自由迁移率m0与标准蛋白质的m0基本交于一点，而且在不同浓度的SDS-凝胶中测得的分子量都相同，则表明此蛋白质在SDS-凝胶电泳中的行为是正常的，可以用SDS-凝胶电泳法测定其分子量。

SDS-PAGE有连续体系及不连续体系两种，这两种体系有各自的样品溶解液及缓冲液，但加样方式，电泳过程及固定、染色与脱色方法完全相同。