中和试验检测应用

病毒或毒素与相应的抗体结合后，失去对易感动物的致病力，谓之中和试验。

本试验主要用于：

（1）从待检血清中检出抗体，或从病料中检出病毒，从而诊断病毒性传染病；

（2）用抗毒素血清检查材料中的毒素或鉴定细菌的毒素类型；

（3）测定抗病毒血清或抗毒素效价；

（4）新分离病毒的鉴定和分型，中和试验不仅可在易感的实验动物体内进行，亦可在细胞培养上或鸡胚上进行。试验方法主要有简单定性试验、固定血清稀释病毒法、固定病毒稀释血清法、空斑减少法等。

1、血清中和实验鉴定新城疫

血清中和实验既可用已知抗鸡新城疫病毒的血清来鉴定可疑病毒，又可用已知的新城疫病毒来测定鸡血清中是否含有特异性抗体，以确定鸡群是否感染过新城疫。中和实验可以在鸡胚或细胞培养以及易感鸡中进行。方法是：在鸡新城疫免疫血清（或待检血清）中，加入一定量的待检病毒（或已知病毒），两者混合均匀后，接种10～11日龄的SPF鸡胚，或鸡胚成纤维细胞，或有易感性的鸡，并设立不加血清的病毒对照。结果注射血清和病毒混合材料的鸡胚或鸡不死亡，鸡胚成纤维细胞无病变，而对照组死亡或细胞培养出现病变，则肯定为新城疫病毒。

2、血清中和实验诊断猪瘟

将不同稀释度的血清与已知浓度的稀释病毒混合，再接种细胞培养物进行培养，18-24h后进行荧光抗体检查；或与猪瘟兔化弱毒疫苗（HCLV）中和，接种到兔中观察兔体温反应，以此确定血清的终点滴度。在西欧最常用的方法是过氧化物酶中和实验（NPLA），而在一些北美洲和拉丁美洲国家则多使用免疫过氧化物酶单层实验（1PMA）方法。

3、血清中和实验检测猪繁殖与呼吸综合征

一般来说，在群体水平上血清学诊断易操作，特异性强，敏感性高。但对个体的检测则比较困难，有时出现非特异性反应，但可以在2～3周后取样复测解决此问题。血清学检测一般用吸附实验（如IPMA、IF、ELISA），这些实验常用某种抗原型的病毒进行，对其他抗原异型病毒抗体的灵敏度较低。

应用抗体结合试验，在病猪感染了7～14天检出抗病毒抗体，30～50天抗体滴度出现高峰。有些在病猪感染后3～6个月内血清转为阴性，有些病猪血清阳性维持较久。中和抗体在病猪感染后出现较慢，但滴度不高。可在感染后3-4周检测到中和抗体，这种抗体能维持1年或更长时间。

有报道，在血清中和实验中使用补体能提高试验的灵敏度。关于病猪感染后血清阳性持续时间的长短，目前尚未进行广泛深入的研究，因其有可能随实验方法不同而异。母源抗体半衰期为12～14天，一般仔猪在出生后4～8周内可检测到病毒，随母猪生产时的滴度及所用试验方法而异。

在污染的环境中，血清学检测为阳性的母猪所产仔猪能在3～6周龄时血清转为阳性。应用巨噬细胞分离病毒以及利用两类血清型病毒的IPMA在实验室容易操作，这种试验可用MARC-145细胞系增殖欧洲型病毒和美洲型病毒操作。使用MARC-145细胞系做间接免疫荧光实验（1FA）能顺利进行PRRSV血清学反应。目前，灵敏度高、特异性强商品化的ELISA试剂盒已经上市。同时，国内学者还开发了乳胶凝集试剂盒，可用于PRRSV抗体快速监测。

血清中和实验检测PRRS抗体虽然特异性好，但PRRS的SN抗体比IFA抗体在血清中出现得晚，一般在感染后的4～6周才出现中和抗体，因此SN不适宜进行早期诊断。Christianson等（1992）报道SN的敏感性比IFA低，Yoon等（1994）对常规SN进行改良，在实验中加入20%豚鼠血清以增加补体的含量，从而提高SN的敏感性，在感染后的9～11天即可检测到较高滴度的SN抗体。SN抗体比IFA抗体存留的时间长，可维持半年以上。但由于对急性感染的敏感性较差，要求血清无污染，而且细胞培养工作量大，技术性强，目前仅限于实验室研究应用。

4、病毒中和实验（VNT）诊断禽流感

以中和实验来鉴定或滴定流感病毒时，常用鸡胚或组织培养细胞，操作方法与其他病毒（如NDV）的中和实验相同。一般常用固定病毒稀释血清法，IOOEIDs或1000TCID5的AIV与RED处理过的倍比稀释的血清等量混合，室温lh，每个鸡胚或每瓶细胞接种0.2ml，每个稀释度接种4个胚或细胞瓶，37℃孵育72h至7天，检查鸡胚尿囊液的血凝活性或细胞培养物的血细胞吸附作用，按标准方法算出中和效价，不出现血凝活性或血细胞吸附作用的最高稀释度即为血清中和抗体滴定。

NT实验是最敏感而特异的血清学方法，只有抗体与病毒颗粒上的表面抗原相对应、特别是与吸附到宿主细胞上的病毒表面抗原相对应时，才能在实验中取得满意的显示效果。因此，某一个血清型的中和实验抗体只与同组内地其他病原表现出有限的交叉反应。由于病毒中和实验操作烦琐，耗时费料，临床上几乎不用，但作为经典方法在病毒鉴定中起着重要的作用，许多新的检测方法都要以之为标准来进行比较。