ABI Prism 7000型定量PCR仪中文操作手册

1、新建文件菜单File → New，Assay选择Absolute Quantification（实时定量模式），打开一个空白的96孔板文件。

2、探针设置双击任意一个孔，打开Well Inspector窗口。该窗口也可以从菜单View → Well Inspector打开。

3、首次使用软件，或者探针（Detector）没有设置好，请点击Add Detector按钮，打开Detector Manager窗口。该窗口也可以从菜单Tools → Detector Manager打开。如果Detector列表中没有合适的探针，点击按钮File → New，新建探针：设定探针的名称（建议使用所研究基因符号加标记荧光，如GAPDH_FAM、ACTIN_VIC等）、报告基团（FAM或者VIC）、淬灭基团（TaqMan探针选TAMRA；MGB探针选None）、颜色（任意指定）等。设置完成后点击OK，该探针即出现在探针列表中。重复此过程，设立其他的探针。

4、在Detector Manager窗口，从探针列表中点击选择所需探针，按住Ctrl键可以选择多个探针，再点击Add to Plate Document按钮。最后点击Done关闭Detector Manager窗口。此时Well Inspector窗口仍然是打开的。

5、填样品表在96孔表中选定有样品的一个或多个孔，在Well Inspector页面的Sample Name栏中填入样品名称；在探针列表的Use项下的方框中，打钩选择要用的一个或多个探针；在Task栏中选择指定样品类领：阴性对照选NTC；未知样品选Unknown；标准品选Standard。对于Standard，还要在Quantity栏中输入DNA拷贝数。注意：只有在这里输入拷贝数后，软件才能自动生成标准曲线。建议标准品的浓度在5点以上。建议每个样品(包括标准品)都按照统计学要求作一定数量的复管。

6、参比荧光如果使用的是ABI公司的定量PCR试剂，如TaqMan Universal PCR Master Mix或者SYBR Green PCR Master Mix等，参比荧光（Passive Reference）选ROX；如果使用的试剂中不含有参比荧光，请选None。完成后点击右上角的X按钮，关闭Well Inspector窗口。

7、循环参数切换到Instrument页面，设定及修改PCR热循环程序：在ABI公司默认的程序中，50℃ 2 min是UNG酶起作用的步骤，UNG酶可以预防PCR产物（其中以U代替T）对定量PCR的污染；95℃ 10 min的作用是激活金牌Taq酶，同时灭活UNG酶；40个循环的95℃15sec和60℃1min是定量PCR的循环步骤。7000默认在最后一步，也就是60℃1min复性和延伸时收集荧光信号。如果使用ABI公司的定量PCR试剂，上述参数不需要调整，直接运行PCR循环就可以了。在使用其他厂家试剂的情况下，如果其中没有UNG酶，请删除50℃2min步骤；如果使用的不是金牌Taq酶而是其他普通的Taq酶，请删除95℃10min步骤。

8、循环参数的修改方法删除：按住Shift键并在相应的Stage或Step中点击，使该步骤被选中变黑，再按Del键即可删除。插入：在需要插入参数的位置点击，出现粗黑竖线后，分别点击Add Hold、Add Cycle或Add Step按钮添加保温、循环或循环中的一个步骤。修改温度和时间：拖动鼠标，选中需要修改的温度或时间数字，输入新的数值即可。

9、其他设置反应体积：定量PCR的标准反应体积是50µl；如果想修改的话，建议大于25µl。融解曲线试验：在Dissociation Protocol选项左边的方框中打钩，仪器即在定量PCR循环完成后继续做融解曲线试验。如果是采用SYBR Green I染料方法进行定量研究，建议进行融解曲线试验，以判定PCR反应特异与否。单峰表示单一的PCR扩增产物，多峰表示PCR扩增有杂带。注意：只有SYBR Green I染料方法才需要进行融解曲线试验，TaqMan探针和MGB探针法都不需要。9600 Emulation：选中此项，即可使7000的升降温速度减慢，与9600和7700一样，从而可以直接使用在9600、7700型PCR仪上优化好的循环条件，而不需任何修改。

10、启动扩增点Save按钮保存文件设置。确认96孔板或全部样品管在主机内放置妥当后，点击Start按钮，开始PCR循环。屏幕上动态显示PCR进程和剩余时间。

11、监控进程切换到Results页面的Amp Plot子页面，可以实时显示PCR曲线随着循环增加而逐步增长的实际情况。如果Detector选FAM或VIC，只显示对应探针的变化情况；如果选All，则同时显示所有探针的反应进程。

12、保存结果程序结束后，点Disconnect按钮，然后File → Save保存实验结果。可以保存为.sds格式，也可以保存为.sdt格式，作为以后同类实验的模板，节省软件设置时间。