RNA抽提实战经验总结
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组织RNA 抽提失败的两大现象是: RNA 降解和组织内杂质的残留。 关于降解问题,首先看一下为什么从培养细胞中抽提RNA 不容易降解。现有的RNA 抽提试剂,都含有快速抑制 Rnase 的成分 。在培养细胞中加入裂解液,简单的混匀,即可使所有的细胞与裂解液充分混匀,细胞被彻底裂解。
细胞被裂解后,裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的 Rnase,所以RNA 得以保持完整。也就是说,培养细胞由于很容易迅速与裂解液充分接触,所以其RNA 不容易被降解 ;反过来讲,组织中的 RNA 之所以容易被降解,是因为组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触所致 。因此,假定有一种办法,在抑制 RNA 活性的同时能使组织变成单个细胞,降解问题也就可以彻底解决了。
液氮碾磨就是最有效的这样一种办法。 但是,液氮碾磨方法非常麻烦,如果碰到样品数比较多的时候更加会有此感觉。这样就产生了退而求其次的方法:匀浆器 。匀浆器方法没有考虑细胞与裂解液接触前如何抑制 Rnase 活性这个问题,而是祈祷破碎组织的速度比细胞内的 Rnase 降解 RNA 的速度快。电动匀浆器效果较好,玻璃匀浆器效果较差,但总的来说,匀浆器方法是不能杜绝降解现象的 。
因此,如果抽提出现降解,原来用电动匀浆器的,改用液氮碾磨;原来用玻璃匀浆器的,改用电动匀浆器或者直接用液氮碾磨,问题几乎100% 能获得解决。影响后续实验的杂质残留问题,其原因比降解更多样,解决方法相应也不同。总之,如果出现降解现象或者组织内杂质残留现象,则必须对具体实验材料的抽提方法/试剂进行优化。优化大可不必使用您的宝贵样品:可以从市场上购买一些鱼/鸡之类的小动物,取相应部分的材料用于 RNA 抽提,其它部分用于抽提蛋白质 – 用嘴碾磨,肠胃抽提。
实验前方法/试剂的选择
RNA 用于不同的后续实验,其质量要求不尽相同。cDNA 文库构建要求RNA 完整而无酶反应抑制物残留 ;Northern 对 RNA 完整性要求较高,对酶反应抑制物残留要求较低;RT-PCR 对 RNA 完整性要求不太高,但对酶反应抑制物残留要求严格。投入决定产出;每次都以获得最高纯度的 RNA 为目的,劳民伤财。