大规模动物细胞培养的问题及对策

动物细胞培养开始于本世纪初，到1962年规模开始扩大，发展至今已成为生物、医学研究和应用中广泛采用的技术方法，利用动物细胞培养生产具有重要医用价值的酶、生长因子、疫苗和单抗等，已成为医药生物高技术产业的重要部分。由于动物细胞体外培养的生物学特性、相关产品结构的复杂性和质量以及一致性要求，动物细胞大规模培养技术仍难于满足具有重要医用价值生物制品的规模生产的需求，迫切需要进一步研究和发展细胞培养工艺。目前，世界众多研究领域集中在优化细胞培养环境、改变细胞特性、提高产品的产率并保证其质量和一致性上。

细胞培养环境

细胞培养环境中抑制因素的积聚是提高细胞密度的主要限制因素。体外动物细胞培养中氨离子的积累是抑制细胞生长的主要因素之一。氨的积聚使细胞内UDP氨基己糖(UDP-N-乙酰葡糖胺和UDP-N-乙酰半乳糖胺)增加，影响细胞的生长及蛋白的糖基化过程。氨抑制Gln代谢途径，使Asp和Glu消耗增加。细胞消耗Asp增加，可能是细胞线粒体膜上苹果酸－天冬氨酸泵转运NADH加快，使细胞维持糖酵解途径的需要。Asp消耗增加可能会从Gln代谢多经天冬氨酸转氨酶途径而不是丙氨酸转氨酶或谷氨酸脱氢酶途径得以补偿。

氨来源于两方面：一是直接来源于培养基，一是细胞代谢所产生。但两者都涉及谷氨酰胺，因此需要防止培养基中Gln自然分解，限制Gln用量，并尽量去除培养基中的氨。

乳酸是细胞糖代谢的产物。高浓度乳酸会抑制乳酸脱氢酶(LDH），从而减少乳酸产生。LDH受抑制后阻止了NADH向NAD的再生及其偶联的丙酮酸/乳酸转换，从而导致NADH增加。NADH增加，部分抑制糖酵解。乳酸抑制糖酵解也导致低浓度丙酮酸，从而导致Gln消耗减少。由于糖酵解和Gln的分解速度降低，能量产生减少，更多的能量用于维持离子浓度梯度，因此高乳酸浓度必将抑制细胞生长。

氨和乳酸对细胞的毒性作用已在多种不同的细胞系有大量报道，不同细胞系对于这两种代谢产物的耐受性差别很大，原因可能是不同细胞系葡萄糖和谷氨酰胺代谢过程中关键酶的敏感性不同，或者在不良生长环境下，细胞转换代谢途径，特别是氨基酸代谢的改变。由于Gln和葡萄糖代谢的相互影响，因此降低培养基中葡萄糖浓度以减少乳酸产生的同时，必须平衡葡萄糖和Gln的比例。这些代谢改变机理的研究将有利于设计适当的控制方案。

随着细胞培养规模和培养密度的增大，由于二氧化碳的产生速率比通过换气从培养基中去除二氧化碳快因而导致CO2积聚，从而对细胞产生毒性作用或者改变细胞代谢水平。CHO细胞大规模培养的生物反应器中，最适CO2水平为4%～10％。当达到14％时便会阻碍细胞生长。在一定的pH条件下，CO2分压升高会使培养基渗透压升高。常规/高渗透压条件下，高CO2分压使重组CHO细胞系的生长和组织型纤溶酶原激活剂(tPA)产率均受到抑制。

当CO2分压升高时，tPA糖链中包含N-羟乙酰神经氨酸的唾液酸比例稍下降，但tPA的总唾液酸含量、其他单糖含量、tPA的I型II型相对含量、表面电荷分布和高－甘露糖单糖比例等影响产品质量及一致性的因素在高CO2条件下也没有改变。这表明CHO细胞生产tPA具有很强糖基化能力。尽管如此，控制通气参数，平衡氧的输送及CO2的去除，防止生物反应器运转中CO2积聚仍是明智选择。

甲基乙二醛(MG)主要是丙糖磷酸去除磷酸基后的代谢产物，也是脂类、氨基酸代谢的产物，对于细胞有潜在的损伤作用。MG能改变氨基酸、蛋白质和核酸的氨基和巯基。细胞内MG的水平由乙二醛缩酶和还原酶两种酶的活性来平衡，代谢途径是糖酵解途径。

葡萄糖浓度很高(100mM)时，细胞内MG几乎是正常培养条件下的两倍。增加培养基中谷氨酰胺浓度也会引起MG中度增加。用腐败假单胞菌乙二醛缩酶基因转染的CHO细胞中乙二醛缩酶活性增长至三倍多，MG浓度比野生型CHO低。

然而，MG浓度降低的细胞与在典型生物反应器培养条件下的细胞的生长活力有何不同尚未确定。通过批次培养中限制葡萄糖用量来降低葡萄糖消耗，由此来确定降低糖酵解代谢是否导致细胞内MG浓度降低，从而最终确定MG浓度降低是否提高培养活力或影响产品特性的研究具有重要意义。另外，培养基中加入胎牛血清可降低MG浓度。

不管用NaCl、KCl还是蔗糖升高渗透压，均可增加批次培养中抗体浓度。细胞系间产率增加幅度不一，对骨髓瘤细胞影响较小。高渗透压不仅影响细胞批次培养中抗体或tPA产量，而且影响细胞生长速度、对数生长期的长短、细胞死亡的速度。由于细胞生长环境不断变化，有关渗透压影响的量化进展不大。然而，在大约400mOsm的范围内，细胞虽然生长减慢，但特定抗体产生增多，细胞浓度增大导致最终高产品浓度。

另外，在培养基中加入诸如甘氨酸甜菜碱、三甲基甘氨酸或脯氨酸等渗透压保护剂在一定程度上减轻了高渗透压对细胞的生长抑制作用，但不影响细胞表达目的蛋白质的水平，同时可使细胞较长时间的维持高水平表达。

多孔微载体的研制替代了容易使细胞受机械搅拌与喷气损伤的常规载体。为创造更大优势，多孔微载体内部保护空间必须保证细胞能够进入生长。对于有些细胞株尽管能贴在微载体内，但“移动性”很差，因此需要发明一种更好的培养方式，提高微孔的开放性或者改善其表面特性，从而提高细胞贴壁率同时增加细胞移动性。

2、细胞死亡与凋亡

大规模细胞培养的后期，维持细胞高的活力是个富有挑战性的课题。最初的研究似乎表明细胞死亡大多由于坏死，而人们逐渐认识到至少是一些细胞系在生物反应器中细胞死亡主要原因是细胞凋亡。随着细胞凋亡分子机制研究的不断深入，细胞凋亡的发生被认为是大规模细胞培养过程的重要制约环节，预防并控制细胞凋亡也因此成为研究热点。

用基因工程方法将bcl-2基因这种细胞凋亡抑制基因导入细胞，成为众多研究者的选择。bcl-2基因的过量表达能抑制Gln或氧缺乏引起的细胞凋亡，减少细胞特定营养成分的消耗，提高细胞密度和目的蛋白产量,这对于细胞大规模培养具有重大意义。对细胞的这种保护作用依赖于bcl-2等抑制基因的高水平表达。因此，需要寻求在低表达水平便可达到目的的更强的细胞凋亡抑制基因。

在大规模动物细胞培养条件下，细胞凋亡/死亡多是在营养成分耗尽、有毒代谢产物增多时发生。因此一种“细胞静止”过程可以有效降低营养成分消耗和代谢毒物产生，提高CHO细胞的目的蛋白产率。方法是向CHO细胞中导入p21、p27的基因，使细胞周期中G1期延长(细胞静止)，改造后，细胞活力正常，外源基因表达蛋白量提高。其优点是产品成本降低，产量提高，遗传一致性高。

3、培养基与细胞系

动物细胞培养基是细胞赖以体外生长、增殖、分化的重要因素。在经历了天然培养基、合成培养基后，无血清培养基成为当今细胞培养领域研究的一大课题。无血清培养基的优势在于避免了血清的批次、质量、成分等对细胞培养造成的污染、毒性作用和不利于产品纯化等不良影响。在生产疫苗、单抗和各种生物活性蛋白等生物制品的应用领域中，优化无血清培养基的成分可使不同的细胞在最有利于细胞生长和表达目的产物的环境中维持高密度培养。但无血清培养基并不适用于广泛的细胞类型，不同类型的细胞甚至不同的细胞系或细胞株都有可能有各自的无血清培养基构成。在细胞早期培养阶段，细胞对于无血清培养基的适应性往往是克隆特异性的，每个新的克隆常需要重新配制培养基和适应过程。最近研究表明，先使野生型宿主CHO细胞适应无血清培养基培养，然后转染这些细胞得到的重组克隆在基因扩增后保持了在无血清培养基悬浮培养中的生长能力，其产品在生化和结构上类似于未处理的宿主细胞产物。

有些细胞株依赖于血清源性生长因子的特性可通过分子遗传途径予以改变，即导入特异生长因子的基因，使细胞能合成自身的生长因子来满足细胞生长需要，而对细胞生长无副作用。另外，导入一些基因改变细胞生长周期的调控也可使细胞在无血清/蛋白的培养基中生长。

通过细胞工程方法使细胞高水平表达外源基因并正确加工表达产物，从而提高整个表达系统的产率，也成为应用大规模动物细胞培养生产外源目的蛋白的研究的重要手段。这种潜在的目标便是改变细胞的蛋白加工能力。tPA表达水平及分泌效率均和它与内质网膜上的结合蛋白(BiP)这种分子伴侣的结合程度负相关。通过表达反义BiP转录物，tPA突变体与BiP的结合减少而分泌增加。在CHO细胞中通过稳定转染并过量表达BiP，阻止了未糖基化tPA突变体的分泌。因此，控制细胞中的分子伴侣能够使细胞正确折叠、组装、定位、分泌新合成的重组蛋白从而提高产量。

另外，控制外源基因表达的启动子的特性是基因表达的基础之一。强的启动子成为众所周知的选择。但是，SV40早期启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子调控基因表达均发生在S期，CHO细胞中腺病毒主要晚期启动子(AMLP)调控外源基因表达是在G1期。对于利用重组动物细胞生产外源蛋白而言，S期表达需要提高细胞的生长速率，在批次或灌流培养中会严重降低产量；G1期表达将使细胞在高密度培养条件下保持较低生长速率而大量生产蛋白。构建细胞系时，细胞周期特异表达调控具有重要研究和应用意义。

4、过程监控

大规模动物细胞培养中由于大量细胞的代谢，细胞培养环境迅速改变，在线过程监控更为重要。离线取样测定特别是产物浓度测定往往需要一天的时间，因此这种测定结果，不能用来及时指导生物反应器有关参数的控制和细胞培养环境的优化，而且频繁取样容易造成污染，增加费用。因此在线测定生物反应器中培养条件、代谢产物和目的产物浓度等大量数据，并对测定结果进行分析处理，及时对培养系统进行反馈性控制是成功进行大规模动物细胞培养的需要。

在生物反应器中，温度、pH值、溶解氧浓度是细胞培养规模放大的早期研究内容。现在，这三个参数对细胞的影响已经明确，并在培养过程中实行了有效控制。

最近几年中有关细胞培养过程监控的研究迅速增多。测量在线氧吸收速率确定从细胞生长期生产病毒到病毒感染期和细胞死亡后终止感染的转换时间；用在线葡萄糖分析仪的测定调整灌流速度；测定氧消耗估计营养供应率的代谢负荷和控制；测定氧吸收速率估测ATP的形成；测量在线氧化还原能力作为活细胞浓度的指标等等众多特定参数均得以测定并加以应用。细胞呼吸商似乎是衡量细胞生理状态的潜在的有用参数，可测定在线氧吸收速率并用质谱仪分析废气中二氧化碳呼出率计算呼吸商。一般来说，呼吸商应接近1.0，这就要求细胞培养中尽量降低氧消耗和二氧化碳排出。

用亲和层析与在线取样系统偶联进行在线蛋白质含量测定的方法已经完成。另外，用在线蛋白分解与反相色谱监测重组蛋白的糖基化以了解产品的一致性也成为一项有应用价值的技术。

5、结论与展望

可以推断，更多的代谢中间产物对细胞培养的细微影响和机理将逐渐得以充分认识。对这些因素加以调节可以简化筛选特定克隆的方法。细胞培养营养需要的重点将继续朝着维持或增加产品质量及一致性上努力。基因改建在筛选、扩增目的基因及控制其表达或增强细胞寿命等方面显示出强大生命力。改善细胞环境是当前众多生物反应器及控制器研究者的不懈努力方向。随着对细胞生长和产物生成之间相关性研究的深入，对生物反应器更多培养状态参数的在线检测以及各种新细胞生物反应器系统的开发利用，新的培养/控制模式将会在现有基础上不断产生。不断成熟的大规模动物细胞培养技术不仅在生产药用蛋白方面，而且在基因治疗、基因疫苗用的病毒载体的生产、人工器官和组织移植用分化细胞的培养等研究领域都具有广阔的应用前景。