PCR-SSCP 技术实验

实验原理

聚合酶链式反应-单链构象多态（Polymerase Chain Reaction-Single Strand Conformation Polymorphism，PCR-SSCP）技术是在PCR技术基础上发展起来的，它是一种简单、快速、经济的用来显示在PCR反应产物中单碱基突变（点突变）的手段。该方法已被用做癌基因和抑癌基因突变的筛查检测，遗传病的致病基因分析和基因诊断，基因制图等领域。

在SSCP测定中，双链DNA（dsDNA）被变性成为单链DNA（ssDNA），每一条单链DNA都基于它们的内部序列而呈现出一种独有的折叠构象，即使同样长度的DNA单链因其碱基顺序不同、甚至单个碱基的不同会形成不同的构象。这些单链DNA在非变性条件下，用非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，单链DNA的迁移率和带型，都取决于其折叠构象和电泳时的温度。

试剂与材料

1．样本DNA（100 ng/ml）、MTHFR上下游引物（5 pmol/ml）、Taq DNA聚合酶（5 U/ml）、10×PCR反应缓冲液、4×dNTPs（2.5 mmol/L）、30%丙烯酰胺（交联度49:1）、5×TBE缓冲液、10%过硫酸铵（现用现配）、TEMED、甲酰胺上样缓冲液、固定液、银染液、显色液。

2．微量加样器、PCR自动热循环仪、聚丙烯酰胺凝胶电泳装置。

实验步骤

一、PCR反应

20 ml反应体系成分如下：

模板DNA（100 ng/ml） 1 ml

10×PCR反应缓冲液 2 ml

Taq DNA聚合酶（5 U/ml） 0.2 ml

4×dNTPs（2.5 mmol/L） 1 ml

MTHFR上下游引物 各 1 ml

ddH2O 加至终体积 20 ml

PCR反应循环参数：

95℃ 5 min；

94℃ 30 s、62℃ 50 s、72℃ 90 s，共30个循环；

72℃ 7 min。

反应结束后，置4℃保存。

二、非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

1．制备6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶：30%聚丙烯酰胺（交联度49:1）10 ml，5×TBE缓冲液10 ml，加蒸馏水至50 ml，加TEMED 25 ml、10%过硫酸铵250 ml，混匀后灌胶，插入加样梳子。待胶完全聚合后，拔出加样梳子，安装电泳装置，加入电泳缓冲液（1×TBE），缓冲液应高于加样孔上缘，用注射器吸取缓冲液冲净加样孔。

2．取5 ml 扩增产物加10 ml变性上样缓冲液混匀，98℃变性10 min，迅速冰浴。

3．取5 ml混合液加到点样孔中，以1～8 V/cm电泳4～5 h。

三、聚丙烯酰胺凝胶染色

1．拆下电泳装置，取出聚丙烯酰胺凝胶，放到一个塑料盘内，用蒸馏水冲洗1～2遍。

2．倒入固定液，固定8～10 min。

3．用蒸馏水冲洗1～2遍；倒入银染液，银染10～12 min。

4．用蒸馏水冲洗若干遍；倒入显色液，显色至出现清晰的银染带。

5．用蒸馏水浸泡聚丙烯酰胺凝胶，观察PCR-SSCP结果。

结果判断

观察并记录聚丙烯酰胺凝胶上的DNA单链带，根据异常泳动变位筛查突变样本。

应用

在遗传学方面的有广泛的应用，例如，癌基因或抑癌基因的基因突变的筛查，遗传病的致病基因的突变筛查和基因诊断等。

注意事项

1．靶DNA序列长度不宜过长，否则灵敏度下降。

2．DNA样品在电场中泳动的长度一般要求在16～18 cm以上。

3．染色最好在塑料盘中进行。