自己翻译的罗氏tunel检测细胞凋亡试剂盒说明书

注意：Label 溶液含有甲次砷酸盐和二氯化钴，严禁吸入和食入。 反应悬浮物收集于密闭、不易碎、有明确标识的容器中，按有毒废物处理。

试剂盒组成：
小瓶/盖子 1 蓝色 标签 酶溶液 内容物 大肠杆菌重组牛胸腺末端脱氧核苷酸转移 酶，在 storage buffer 中 10×conc. 5×50ul 在 reaction buffer 中的核苷酸混合物 1×conc. 5×550ul 抗荧光素抗体，绵羊 Fab 片段，连接有辣根 过氧化物酶 Ready-to-use 3.5ml

2 紫色

标记溶液

3 黄色

转化-POD

需要自己配置的其他物品：

除上表所列试剂外，还需准备以下溶液。

下表列出每步所需物品概览： 步骤 样品准备 section 3.2 黏附细胞， 细胞涂片和细 胞 离 心 涂 片 准 备 section3.2.1 冰冻组织 section3.2.2.2 Washing buffer：磷酸缓冲液 PBundefined Bloking buffer 封闭缓冲液：溶于甲醇的 3%H2O2 Fixation solution 固定剂：溶于 PBS 的 4%多聚甲醛， ph7.4，新鲜配制 Permeabilisation solution 渗透溶液：溶于 0.1%柠檬酸钠 的 0.1%Triton X-100，新鲜配制（6）

固定剂 二甲苯和乙醇（浓度：95%，90%，80%，70%，溶于双 蒸水中） Washing buffer：PBundefined 蛋白酶 undefined，不含核酸酶，工作浓度：[10-20ug/ml，溶于 10mM Tris/HCL 中，ph7.4-8] 替代处理方案 ※渗透溶液： （0.1%Triton1） X-100，溶于 0.1%柠檬酸 钠的，新鲜配制 ※胃蛋白酶（0.25%-0.5%，溶于盐酸中，ph2）或胰蛋 白酶，0.01N HCL，不含核酸酶 ※0.1M 柠檬酸缓冲液，ph6，微波照射 微球菌核酸酶或 设备 试剂

石蜡包埋组织 section3.2.2.1

标记步骤 section3.3 阳性对照 section3.3.1

DNase I，重组，级别 undefined 黏附细胞， 细胞涂片和细 胞离心涂片和组织 section3.3.2 Difficult tissue 困难组织 Parafilm 石蜡封 口膜或盖片 湿盒 塑料容器 微波 湿盒 Washing buffer：PBundefined

Citrate buffer 柠檬酸盐缓冲液，0.1M，ph6.0 Washing buffer：PBundefined Tris-HCL，0.1M ph7.5，含 3%的 BSundefined和 20%正常牛血 清 Washing buffer：PBundefined DAB Metal Enhanced Substrate SeundefinedDAB 金属增强底物_或 POD 底物替代物 光镜镜检封固剂

信号转换 section3.4 湿盒 Parafilm 石蜡封 口膜或盖片

产品概述：

特异性：TUNEL 反应优先标记凋亡产生的 DNA 链断裂，从而辨别凋亡与坏死、以及由抑 制细胞生长的药物或放射线产生的 primary DNA 链断裂 实验干扰：假阴性：在某些型式的凋亡细胞中 DNA 链断裂可能缺失或不完全。空间位阻， 如细胞外元件可能阻止 TdT 到达 DNA 断裂处。两种情况均能产生假阴性。 假阳性：在坏死晚期，可能产生大量的 DNA 片段 DNA 链断裂也可能在具有高增殖和代谢活动的细胞中出现。

两种情况均能产生 假阳性。为确认细胞死亡的凋亡型式，应认真进行每种细胞的形态学检查 凋亡过程中产生的形态学改变尤其特征形式，因此，对于可以结果进行解释时， 细胞形态评估是一项重要的参数。

样本：细胞离心涂片和细胞涂片 在 chamber slides 上培养的黏附细胞 冰冻或福尔马林固定、石蜡包埋样本 分析时间：2-3 小时，除外培养、固定和渗透 检测次数：一个试剂盒 50T 试剂盒存储/稳定性：未开封试剂盒储存于-15～-25℃可稳定至标签上标明的效期。 试剂 TUNEL 反应混合物 转化-POD 储存和稳定性 TUNEL 反应混合物应在用前临时配制，不能储存 TUNEL 反应混合物用前应置于冰上 一旦融化转化-POD 溶液后，应储存于 2-8℃（最长稳定 6 个 月） 注意：禁止冰冻结冰

优点：
优点 灵敏 特异 快速 简便 灵活 特点 在单个细胞水平检测细胞凋亡的早期间断 对坏死来说，优先标记凋亡 分析时间短（2-3h） 试剂稳定、优化，没有稀释步骤 适合于固定细胞核组织，允许堆积、贮存和转运样本

双染可以鉴定细胞凋亡的类型和阶段 Function-tested 功能检查 对于大量的批号来说，每一批号均进行了功能检测

步骤和所需材料：

2 样品准备
2.1 黏附细胞、细胞涂片和细胞离心涂片 需准备的其他试剂：Washing buffer：磷酸盐缓冲液（PBS） Blocking buffer 封闭溶液：甲醇稀释的 3% H2O2 Fixation solution 固定溶液：PBS 配制的 4%多聚甲醛，ph 7.4，新鲜配制 ） Permeabilisation solution 渗透液： 0.1%Triton1 X-100 溶于 0.1%柠檬酸钠 溶液中，新鲜配制 步骤：下表描述了细胞固定、内源性过氧化物酶封闭和细胞渗透过程。 注意：固定和渗透另外两个细胞样本用于银杏和阳性对照 步骤 1 2 3 操作 用新鲜配制的固定液固定风干的细胞样本，1h，15-25℃ 用 PBS 冲洗玻片 用封闭液孵育，10min，15-25℃

用 PBS 冲洗玻片 用渗透液孵育，2min，置于冰上 2-8℃ 按 3.3 操作

2.2 组织部分 2.2.1 福尔马林-包埋组织 福尔马林包埋组织的预处理：可按 4 种不同的方式预处理。如用蛋白酶 K，不含核酸酶，浓 度、孵育时间和温度应按组织类型优化 注意： 只用罗氏应用科学的蛋白酶 K， 因其经检测不含核酸酶， 核酸酶可导致假阳性。

另外 3 中替代方法在下表中描述（step 2） 需准备的其他试剂：二甲苯和乙醇（浓度：95%，90%，80%，70%，溶于双蒸水中） Washing buffer：PBS 蛋白酶 K，不含核酸酶，工作浓度：[10-20ug/ml，溶于 10mM Tris/HCL 中，ph7.4-8] 替代处理方案 ） ※渗透溶液：0.1%Triton1 X-100，溶于 0.1%柠檬酸钠的，新鲜配制 ※胃蛋白酶_0.25~7~F0.5~7， （ 溶于盐酸中， ph2） 或胰蛋白酶， 0.01N HCL， 不含核酸酶 ※0.1M 柠檬酸缓冲液，ph6。

微波照射 步骤：下表描述了用蛋白酶 K（不含核酸酶）和 3 中替代方法预处理福尔马林-包埋组织的 方法 注意：加入额外的组织用于阴性和阳性对照 步骤 1 2 操作 按照标准操作脱蜡和再水化组织（e.g. 60℃加热，二甲苯浸洗，一系列梯度酒精和双 蒸水再水化 用蛋白酶 K 工作液于 21-37℃中孵育 15-30min 替代方法 1.渗透液 2. 胃蛋白酶或胰蛋白酶 3.微波射线 孵育 8 min 37℃孵育 15-60min 将玻片置于含有 200ml 0.1 M 柠檬酸盐缓冲液，ph6.0 的塑料容器中 350 W 微波放射 5 min 操作

用 PBS 冲洗两次 按 3.3 操作

2.2.2 冰冻组织处理

3 标记草案
3.1 开始之前 准备 TUNEL 反应混合液：每一对管子（小瓶 1：酶溶液，小瓶 2：标记溶液）足以用于 50ul 反应体系的 10 张片子，和 2 个 50ul 标记溶液的阴性对照。 注意： TUNEL 反应混合液应于用前临时配制， 不能储存。 TUNEL 反应混合液用前置于冰上

操作 取 100ul 标记溶液（小瓶 2）用于阴性对照 加入总量 50ul 的酶溶液（小瓶 1）于 450ul 的标记溶液中，以获得 500 ul TUNEL 反应混合液 充分混匀

需准备的其他试剂：微球菌核酸酶或 DNase I，重组，级别 undefined 对照：每次实验应包含两个阴性对照和一个阳性对照应 阴性对照 阳性对照 孵育固定和渗透的细胞于 50ul/标记溶液中（无末端转移酶） ，替代用 TUNEL 反应混合液孵育 孵 育 固 定 和 渗 透 的 细 胞 于 微 球 菌 核 酸 酶 或 DNase I ， 重 组 ， 级 别 1 中 （3000U/ml-3U/ml 于 50mM Tris-HCL 中， ph7.5， 10mM MgCL2， 1mg/ml BSA） 10min，15-25℃，以诱导在标记前 DNA 链断裂

3.2 黏附细胞、细胞涂片、细胞离心涂片和组织标记草案 需准备的其他设备和试剂：Washing buffer：PBS 湿盒 Parafilm 石蜡封口膜或盖片 步骤：参考下表 步骤 1 2 3 操作 用 PBS 冲洗两次 使样品周围区域变干 加入 50ul TUNEL 反应混合液于样品上 注意： 阴性对照加入 50ul 标记溶液。 确保 TUNEL 反应混合液均匀分布于单层细胞 上，避免蒸发丢失。孵育时样品上应覆盖 Parafilm 石蜡封口膜或盖片 在湿盒、暗室中加盖孵育 60min，37℃ 用 PBS 冲洗 3 次 可在样品上加入 1 滴 PBS， 于荧光显微镜下观察。 激发光波长 450-500 nm， 515-565 在 nm（绿色）范围类检测

3.3 困难组织标记草案（略） 3.4 信号转换 需要准备的其他设备和试剂：Washing buffer：PBS 湿盒 Parafilm 石蜡封口膜或盖片 DABA 底物或 POD 替代底物 光镜镜检封固剂 步骤：按照下表操作 步骤 1 2 操作 使样品周围区域变干 加入 50 ul 转化-POD（小瓶 3）于样品上

注意：确保转化-POD 溶液均匀分布于单层细胞上，避免蒸发丢失。孵育时样 品上应覆盖 Parafilm 石蜡封口膜或盖片 3 4 5 6 7 8 在湿盒中孵育 30min，37℃ 用 PBS 冲洗 3 次 加入 50-100ul DAB 底物或 POD 替代底物 于 15-25℃孵育 10min 用 PBS 冲洗 3 次 用玻璃盖片封固（e.g. 用 PBS/甘油） ，光镜下检查 替代方法：光镜检查前可复染

4. 附件： 4.1 Troubleshooting 问题 非特 异性 标记 步骤/试剂 包埋组织 可能原因 紫外辐射用于包埋组织的聚 合（e.g.异丁烯酸盐导致 DNA 链断裂） 建议 使用不同的包埋材料或不用的聚合 试剂

固定

酸性固定剂 （e.g. 甲安菲他明， 使用 4%多聚甲醛 Carnoy’s 使用福尔马林或戊二醛 固定剂） TdT 浓度太高 内源性 POD 活性 抗-银光素-POD 非特异性连接 用 TUNEL 稀释缓冲液 1:2 至 1:10 稀释 TdT 浓度 细胞渗透前， 浸入 3% H2O2 甲醇稀 释液 10min，封闭内源性 POD 用正常抗绵羊血清封闭 用含 3% BSA 的 PBS 封闭 20min 减少转化溶液浓度 50% 取得器官后立即固定组织

通过肝静脉灌注固定剂 用含有 ddUTP 和 dATP 的溶液封闭 使用甲醇固定，但同时应考虑甲醇 固定可能降低灵敏度 用 TUNEL 稀释缓冲液使标记混合 物浓度降低 50% 细胞渗透前， 浸入 3% H2O2 甲醇稀 释液 10min，封闭内源性 POD 用正常抗绵羊血清封闭 用含 3% BSA 的 PBS 封闭 20min 减少转化溶液浓度 50% 支原体检测试剂盒 双染，e.g.用 Annexin-V-Fluos 注 意 ： Measuring via microplate reader not possible because of too high background.

TUNEL 反应 转化步骤

核酸酶

某些组织（e.g. 平滑肌，组织 准备后很快出现 DNA 断裂） 某些酶仍有活性 福尔马林固定导致含有黑色 素前体的细胞黄染 对于乳腺癌，标记混合物浓度 太高 内源性 POD 活性 抗-银光素-POD 非特异性连接

背景 高

固定 TUNEL 反应 转化步骤

样品

支原体污染 高增殖细胞 (责任编辑：大汉昆仑王)