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流式荧光技术引领肿瘤标志物联合检测进入高通量时代

透景生命科学

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肿瘤标志物在肿瘤的临床诊断和治疗中占有重要地位,通过对血液或体液中肿瘤标志物存在或含量的检测,不仅可用于肿瘤的普查、早期诊断、辅助诊断、良恶性鉴别和临床分期,同时对监测疗效、判断预后、预测肿瘤的复发和转移也具有重要价值。

临床上由于大部分单个肿瘤标志物敏感性或特异性偏低(一种肿瘤可以分泌多种肿瘤标志物,而不同的肿瘤或同种肿瘤的不同组织类型可有相同的肿瘤标志物),而且在不同的肿瘤患者体内,肿瘤标志物的质和量变化也较大。因此,单独检测一种肿瘤标志物可能会因为测定方法的灵敏度不性,一般提倡联合检测多种肿瘤标志物有利于提高检出的阳性率和特异性。基本原则是合理选择不同性质、灵敏度s、特异性能互的相对敏感的多个标志物,进行联合检测,提高肿瘤标志物的应用价值。

肿瘤标志物可用生物化学、免疫学及分子生物学等方法进行测定,目前越来越多地使用免疫检测法。

随着单克隆抗体技术的不断成熟、完善,肿瘤标志物的免疫学测定方法不断得到改进、简化,具有特异、敏感、快速、操作简单、稳定性好、能定量等优点,目前常用的血清肿瘤标志物检测方法包括放射免疫测定(RIA)、酶联免疫测定(ELISA)、化学发光免疫测定(CLIA)、时间分辨荧光免疫测定(TRFIA)等,而且这些已有的检测技术存在一个共同的局限性:每次仅能检测一种肿瘤标志物,因此检测多项指标时不仅将增加被检测者的经济负担,也使检测者耗费更多时间、精力、试剂和标本量。

流式荧光技术是基于xMAP(Flexible Multi-Analyte Profiling)技术的新型多功能生物芯片技术平台。流式荧光技术体系由许多大小均一、颜色不同的直径5.6微米的圆形微球为主要载体,表面进行了一系列的修饰,用以和探针分子偶连。

最常见的是羧基化处理,具有极佳的物理性质与热稳定性,可适合各种蛋白、肽、多糖、脂类、寡核苷酸等生物分子通过化学偶联反应固定于微球上。微球的颜色则是通过在制造过程中按照精确的比例掺入红色和红外两种荧光染料而得到的,调节两种荧光染料的比例可以获得100种不同颜色的微球,即含有100种不同色彩编号(荧光编码)的微球阵列。

不同颜色的微球可以分别携带一种生物探针(探针通过微球上的羧基结合到微球表面),将这些微球混合后加入到一个液相检测体系中,不同的探针可以和不同的目的分子结合,然后加入藻红蛋白(R-Phycoerythrin,R-PE)使微球携带上这种报告分子,采用微流成鞘技术使微球快速单列通过检测通道,并使用红、绿双色激光同时对微球上的红色分类荧光(即微球颜色)和报告分子上的报告荧光(即R-PE发射光)进行检测,从而确定目的分子的种类和数量,完成实时、定性和定量分析。

流式荧光技术是一个开放的分析平台可进行蛋白、核酸等生物大分子的检测以及免疫分析、酶学分析、受体一配基识别分析、核酸研究、蛋白质-蛋白质相互作用及蛋白质.核酸相互作用分析等。

流式荧光技术试剂可在同一反应孔中完成多项指标的检测,克服了传统免疫检测方法一次只能检测一项指标的缺点,实现了高通量、多样本的快速检测。灵敏度高,检测范围广。

流式荧光技术法的标准曲线由5-PL(five-parameter logistic)方式进行拟合,这种拟合方式使得能够被准确定量的浓度范围(动态范dynamic range)更宽,尤其适用于夹心法及多指标免疫测定时。检测线性范围也达到3~4个数量级,远高于CLIA和TRFIA(后二者为2~3个数量级);在最低检测限达到pg级,流式荧光技术检测灵敏度是ELISA的100倍以上,线性范围可达ELISA的10倍以上。样本用量少。

当联合检测高于2项指标时,检测90人份样本,其检测速度与化学发光方法相当,仅需1.5小时,血清标本仅需l0~20微升。在标本用量上流式荧光技术的优势更是显而易见的,这对于某些标本难于获得的情况尤为适用。同时也降低了所需试剂、耗材、人工成本等费用,减轻了患者的经济负担。重复性好。流式荧光技术试剂检测肿瘤标志物的精密度考察结果表明,通常批内CV<5%,批间CV<10%,说明试剂具有较好的重复性。

流式荧光技术的重复性好于ELISA,原因有三:

(1) 没有ELISA中样品需高倍数稀释而造成测定误差;

(2) 直接的荧光检测系统而非ELISA依赖酶放大作用的间接检测;

(3) 每种微球读取50~100个,最终取荧光值的中值作为结果,相当于每个样本重复检测了50~100次,而ELISA仅为双复孔或者三复孔。
利用流式荧光技术这一新型高通量分子检测技术,联合检测多项肿瘤标志物,用于临床上对多种肿瘤的辅助诊断、疗效和预后评价,
以及对无症状人群和高危人群的普查,为快速、准确、高通量检测肿瘤标志物及肿瘤的诊断、治疗提供一种崭新的技术手段。





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