原位 PCR 和原位 RT-PCR 有哪些操作要点？

原位 PCR 是 Hasse 等于 1990 年建立的技术,就是在组织细胞里进行 PCR 反应,它结合了具有细胞定位能力的原位杂交和高度特异敏感的 PCR 技术的优点,是细胞学科研与临床诊断领域里的一项有较大潜力的新技术。

一、仪器设备

英国 Thermo Hybaid 原位 PCR 仪。

二、操作流程

1、原位 PCR 步骤

（1）预处理：

a、切片常规脱蜡；

b、0.2mol/L HCl 处理 10min；

c、5μg/ml 蛋白酶 K 消化组织 37℃10min；

d、Nase 消化组织 37℃ 30min；

e、梯度酒精脱水，室温干燥。

（2）原位扩增：

a、切片滴加特异性序列引物 30μLPCR 扩增反应液，覆盖硅化盖玻片，石蜡油封边；

b、PCR热循环：94℃，1min；55℃，1min；72℃，1.5min，共 25~30 个循环，72℃延伸10min；

c、氯仿洗去盖玻片，4% 多聚甲醛后固定 10min，梯度酒精脱水，干燥。

（3） 原位杂交：

a、加地高辛标记探针的杂交液，98℃ 变性 10min，-20℃ 退火 5min，42℃ 杂交过夜。

b、杂交后用 2×SSC 洗涤 10min，3次，1×SSC 洗涤 10min，3次；

c、缓冲液洗涤 10min，3次；

d、加碱性磷酸酶标记的羊抗地高辛抗体复合物，37℃，2h；

e、缓冲液洗涤 5min，3次；

f、NBT、BCIP 暗处显色，镜下控制，终止显色；

g、常规脱水：透明、封固。

2、原位 RT-PCR 步骤

（1）预处理：

a、蛋白酶K（0.3mg/mL） 54℃ 消化 20min，蒸馏水洗；

b、95℃ 加热 3min，灭活残存的蛋白酶。

（2）原位扩增：

a、在有 RNA 酶抑制剂存在的条件下，用随机六聚物进行逆转录反应；

b、用热启动法进行 PCR 扩增。标本加热至 75℃ 时加上反应液，覆以盖玻片，四周用指甲油密封。然后将温度升至 95℃，2min。再将热循环仪设定为 95℃，45s，55℃，1min 和75℃，45s，共 26 次循环；

c、扩增结束后，在 80℃ 烤 15min~30min。

（3）原位杂交：

a、杂交前标本 95℃ 加热 3min；

b、加上杂交液，湿盒内 50℃ 过夜；杂交液组成：25% 硫酸葡聚糖，2×SSC，50% 甲酰胺，0.33mg/ml 变性的鲑鱼精子 DNA， 每 0.5mL 杂交液内含生物素标记探针 1ng。

c、扩增的 β-肌动蛋白和 IL-6 用 DAKO 检测试剂盒 K600（链霉卵白素，生物素标记的碱性磷酸酶和硝基四氮唑蓝）检测。阳性反应呈紫色。